依赖于靶点稳定性的药物亲和反应实验条件探索

发布时间：2017-06-25 08:05

  本文关键词：依赖于靶点稳定性的药物亲和反应实验条件探索，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的对依赖于靶点稳定性的药物亲和反应(DARTS)这一靶标发现新技术进行主要影响因素的探索,获得DARTS更适宜的实验条件。方法采用不同浓度的链霉蛋白酶(酶与蛋白质量比1∶100~1∶10 000)对Jurkat细胞提取的蛋白混合物进行室温酶解,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色,观察不同浓度链霉蛋白酶对蛋白混合物酶解的程度,以确定DARTS适宜的酶解浓度范围。在此基础上,以α-酮戊二酸为研究对象,采用DARTS联合SDS-PAGE,考察不同链霉蛋白酶浓度(酶与蛋白质量比为1∶500~1∶5000)和不同酶解时长(5~30 min)对DARTS结果的影响,获得适宜的酶解条件。选用靶标已知的麦考酚酸,采用上述实验所得的最适酶解条件进行DARTS,验证其可行性。结果采用不同浓度链酶蛋白酶对蛋白混合物进行酶解时,浓度为1∶100的条件下蛋白完全被水解,酶浓度为1∶10 000对蛋白混合物无明显水解,酶浓度为1∶500~1∶5000较温和,约可水解蛋白混合物的30%~60%。链霉蛋白酶浓度为1∶1000时,α-酮戊二酸的DARTS中受保护的蛋白条带呈现效果最好;在该酶浓度条件下,适宜的酶解时长为15 min。将以上酶解条件(链霉蛋白酶浓度1∶1000、酶解15 min)运用于麦考酸的DARTS,在4~7×10~4处可见明显的保护条带,Western免疫印迹法验证结果显示,保护条带中含有麦考酚酸靶蛋白IMPDH 1。结论以α-酮戊二酸为研究对象,获得了蛋白混合物DARTS更适宜的实验条件。
【作者单位】： 军事医学科学院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室;
【关键词】： 活性小分子化合物 依赖于靶点稳定性的药物亲和反应 靶标发现
【基金】：国家“重大新药创制”科技重大专项资助项目(2012ZX09301003-001-006,2012ZX09301003-004-002,2013ZX09402203003)
【分类号】：R96
【正文快照】： 活性小分子化合物的靶标研究一直都是新药创新性研究的重点和难点。迄今为止,许多经典小分子化合物的结合蛋白皆由基于亲和原理的直接分离方法获得,如通过亲和层析法发现了免疫抑制剂他克莫司(FK506)的结合蛋白FKBP12[1]、环孢菌素A的结合蛋白亲环蛋白[2-3]、沙利度胺致畸的主

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本文编号：481339