多效生长因子蛋白（PTN）的制备及其对前列腺癌细胞顺铂敏感性的影响

发布时间：2017-06-27 10:14

  本文关键词：多效生长因子蛋白（PTN）的制备及其对前列腺癌细胞顺铂敏感性的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：顺铂(DDP)作为一种抗肿瘤药物在多种类的肿瘤细胞中都表现出优良的治疗效果,现已在临床中应用多年。但在使用过程中顺铂所呈现出的细胞耐药性也成了医学界需要攻克的一大难题。Pleitrophin(PTN)又名肝素结合生长因子,它与孕中期肾蛋白(Midkine)生物学功能及基因结构相似,两者组成了一个全新的蛋白家族,命名为肝素结合生长/分化家族。PTN是一种在多种肿瘤细胞内高表达的分泌性蛋白,在某些肿瘤细胞中也表现出一定的抗细胞凋亡活性。在已经发现的与顺铂耐药性关联的抗凋亡蛋白研究中并未见PTN蛋白。本课题从Bxpc-3胰腺癌细胞的c DNA中克隆出PTN基因,并将其克隆到Ptracer-EF/V5-His质粒中,将该真核载体转染293T细胞进行瞬时表达,得到外源表达的PTN蛋白,根据PTN蛋白的促细胞生长功能判断其具有生物学活性,并将其纯化备用。在浓度梯度顺铂作用的PC3细胞中,加入外源表达的PTN蛋白,MTT实验结果证明PTN刺激顺铂处理的PC3细胞后其IC50值较未加PTN组有明显升高,说明PTN蛋白在顺铂作用细胞过程中起到抗凋亡的作用,降低了细胞对顺铂的敏感性;利用不同浓度的PTN蛋白刺激顺铂处理的PC3细胞的流式,结果发现这种对细胞产生的抗凋亡作用呈现一定的浓度依赖性。为了进一步探究PTN蛋白对顺铂敏感性的影响,本研究利用sh-PTN干扰载体沉默PTN蛋白在PC3细胞中的表达,检查细胞对顺铂的敏感性及细胞的凋亡情况。将sh-Scramble、sh-PTN-1、sh-PTN-2转染PC3细胞24h后,比较两种sh-RNA的干扰效率在m RNA及蛋白水平的表达哪种更为明显,琼脂糖电泳及western结果显示sh-PTN-2的干扰效率更佳。在PTN下调的PC3细胞中与正常PC3细胞对比,顺铂对其作用的IC50值有明显的降低,即提高了顺铂的敏感性;随后的流式实验中证明,转染了sh-Scramble质粒的PC3细胞组与Control组相比,加入顺铂后的细胞凋亡情况并未有太大变化,而在转染了sh-PTN-2质粒的PC3细胞中,顺铂诱导该组细胞的凋亡率较前两组有一定幅度的增加,这也证明了PTN的沉默提高了PC3细胞对顺铂的敏感性。同时western blot实验证明在PTN沉默的PC3细胞中,加入顺铂后其C-PARP蛋白的表达量较对照组明显增高,作为又一验证PTN调节顺铂敏感性的指标。综上所述,PTN可能是一种潜在的与顺铂敏感性相关的抗凋亡蛋白,为顺铂耐药性的研究提供了研究基础。
【关键词】：多效生长因子 顺铂 前列腺癌细胞 敏感性 蛋白制备
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 引言11-21
• 1.1 顺铂概述11
• 1.2 铂类化疗药物的概述11-13
• 1.2.1 顺铂12
• 1.2.2 卡铂12
• 1.2.3 奥沙利铂12-13
• 1.3 顺铂的药物作用机制13
• 1.4 顺铂耐药性的因素13-16
• 1.4.1 DNA自我损伤修复13-15
• 1.4.4 抗凋亡蛋白与肿瘤抑制蛋白15-16
• 1.5 PTN基因的发现16
• 1.6 PTN的基因结构与蛋白表达16-17
• 1.7 PTN的生物学功能17-19
• 1.7.1 促有丝分裂作用17
• 1.7.2 促血管形成作用17-18
• 1.7.3 促进细胞轴突的生长活性18
• 1.7.4 参与骨、肾、肺和牙齿的发育过程18-19
• 1.7.5 与癌相关活性19
• 1.7.6 抗凋亡活性19
• 1.8 立题依据19-21
• 第2章 材料和方法21-36
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 细胞株21
• 2.1.2 实验主要仪器21-22
• 2.1.3 主要试剂与材料22-23
• 2.1.4 菌株与质粒23
• 2.1.5 引物及shRNA23
• 2.2 实验方法23-36
• 2.2.1 细胞培养23-24
• 2.2.2 重组质粒的构建24-27
• 2.2.3 外源PTN蛋白的表达27-29
• 2.2.4 纯化外源PTN蛋白29-30
• 2.2.5 外源PTN蛋白促细胞生长实验30-31
• 2.2.6 PTN蛋白刺激对PC3细胞顺铂敏感性的影响31
• 2.2.7 流式细胞仪检测不同浓度的PTN蛋白对顺铂处理的PC3细胞凋亡率的影响31-32
• 2.2.8 PTN-shRNA对PTNmRNA及蛋白水平的影响32-34
• 2.2.9 检查PTN沉默的PC3细胞对顺铂的敏感性34
• 2.2.10 流式细胞术检测抑制PTN表达后顺铂对PC3细胞凋亡的影响34-35
• 2.2.11 检查顺铂作用PTN沉默的PC3细胞中C-PARP的表达35-36
• 第3章 实验结果36-48
• 3.1 PTN表达载体的构建及鉴定36-37
• 3.1.1 在Bxpc-3 细胞中获得PTN基因片段36
• 3.1.2 构建pTracer-EF/V5-His-PTN质粒并酶切鉴定36-37
• 3.2 外源PTN蛋白的表达37-39
• 3.2.1 转染条件的摸索37-38
• 3.2.2 检查外源PTN在 293T细胞中的表达38-39
• 3.2.3 检查外源PTN蛋白表达最佳时间点39
• 3.3 PTN外源蛋白的纯化39-40
• 3.4 外源PTN蛋白的促细胞生长活性检测40
• 3.5 PTN蛋白降低了PC3细胞对顺铂的敏感性40-41
• 3.6 流式细胞术检测不同浓度的PTN对细胞凋亡的影响41-42
• 3.7 抑制PC3细胞中PTN的表达42-45
• 3.7.1 PTN-shRNA质粒转染PC3细胞42-43
• 3.7.2 检查PTN RNA水平的沉默43-44
• 3.7.3 检查PTN蛋白水平的沉默44-45
• 3.8 沉默PTN的PC3细胞对顺铂敏感性增强45-46
• 3.9 流式细胞术检查顺铂对PTN沉默的PC3细胞凋亡的影响46-47
• 3.10 western blot检查Cleaved-PARP47-48
• 第4章 讨论48-51
• 第5章 结论51-52
• 作者及科研成果介绍52-53
• 参考文献53-59
• 致谢59

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