APN抑制剂LJNK与基于APN的协同前药BC-A1的抗肿瘤活性研究

发布时间：2017-07-06 12:14

  本文关键词：APN抑制剂LJNK与基于APN的协同前药BC-A1的抗肿瘤活性研究

  更多相关文章： APN抑制剂 抗肿瘤 侵袭 血管生成 凋亡

【摘要】：研究背景恶性肿瘤的致病因素多,发病机理复杂,这就造成了其治疗的复杂性。目前恶性肿瘤的主要治疗手段包括手术治疗、化学治疗和放射治疗。传统化学治疗药物都存在一定的毒副作用,长期使用容易产生耐药性,限制了肿瘤的治疗效果。氨肽酶N是M1家族的金属蛋白酶,可以从蛋白质和多肽的氨基端降解中性氨基酸,从而参与炎症反应和免疫应答、神经肽和细胞因子的降解、抗原呈递、信号转导以及血管生成等。APN在多种肿瘤组织中过度表达,与肿瘤的生长、增殖、侵袭、转移及肿瘤新生血管形成密切相关,抑制APN的过表达可以诱导肿瘤细胞凋亡。本课题组通过前期的计算机虚拟筛选和初步活性测定,获得了吲哚-2,3-酮类化合物LJNK,该化合物不仅对猪肾微粒体APN表现出了良好的抑制作用和一定的选择性,而且在体外对人肿瘤细胞具有较强的抗增殖作用。在本课题的第一部分中,我们从多个方面对LJNK的体内外抗肿瘤活性进行了评价,对抗肿瘤作用机制进行了研究。化疗药物吉西他滨在肿瘤的化学治疗中起着重要作用。然而,体内迅速代谢失活限制了吉西他滨的临床应用。对吉西他滨N4位进行修饰和改造,可以减缓代谢失活,增加抗肿瘤活性,降低毒副作用。在实验室前期工作中,以酰胺键将bestatin连接到吉西他滨N4位的氨基上,形成协同前药BC-A1。初步活性研究证明了BC-A1在体外对APN酶具有良好的抑制活性。在本课题的第二部分中,我们从多个方面评价了化合物BC-A1的体内外抗肿瘤活性。第一部分吲哚-2,3-酮类APN抑制剂LJNK的抗癌活性研究本课题从以下方面对化合物LJNK抗肿瘤活性进行了研究：(1) LJNK与APN的相互作用：LJNK在和APN的分子对接实验中,与酶的活性位点有效结合。用分光光度法测定了LJNK在体外对APN酶的抑制活性,实验证明,LJNK竞争性结合APN,抑制作用优于bestatirn。(2)体外抗血管生成活性:HUVEC二维管实验和大鼠主动脉环实验表明,LJNK和bestatin剂量依赖性的抑制肿瘤微血管形成,作用强于bestatin。(3)体外抗侵袭活性：transwell实验表明,LJNK对肿瘤细胞ES-2侵袭具有抑制作用,抑制作用的强度稍弱于阳性对照bestatin。(4)体外抗增殖活性：MTT实验和集落生成实验都表明,LJNK对肿瘤细胞增殖具有抑制作用,作用强度强于bestatin。另外,非肿瘤细胞的MTT实验结果表明,在有效抗肿瘤浓度下,LJNK对正常细胞的毒性作用非常弱。(5)体内抗肿瘤增殖活性：通过昆明鼠皮下荷小鼠肝癌H22模型,测定了LJNK在体内对肿瘤的抑制作用。连续给药两周后,LJNK 80 mg/kg/d的肿瘤抑制率达到59.9%,并且实验动物对LJNK有良好的耐受性。(6)初步机制探讨：以流式细胞术和荧光拍照的方法检测了LJNK对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。LJNK可以浓度依赖性的诱导肿瘤细胞凋亡,并且活性高于bestatin。进一步用免疫印迹和caspase酶活力测定的方法,证明了LJNK和bestatin诱导肿瘤细胞中cleaved caspase 3的表达水平上升,caspase 3活力增加。总之,LJNK能够与APN有效结合,抑制APN酶活性,从而抑制肿瘤组织新生血管生成和肿瘤细胞侵袭。LJNK能够在体内外抑制肿瘤增殖,诱导细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。LJNK诱导凋亡与caspase 3相关的凋亡通路有关。第二部分基于bestatin和吉西他滨的协同前药BC-A1的抗癌活性研究本课题从以下方面对化合物BC-A1的体内外抗肿瘤活性进行了研究：(1)APN酶抑制活性：用分光光度法测定BC-A1对APN酶的抑制活性。BC-A1和bestatin对猪肾微粒体APN酶抑制的1C50分别是12.11±2.17μM和4.59±0.43 μM。(2)体外抗血管生成作用：用HUVEC形成二维管实验和大鼠主动脉环实验测定了BC-A1对肿瘤组织新生血管形成的抑制作用,活性明显高于阳性对照bestatin 。(3)体外抗侵袭活性：用transwell法测定了BC-A1对肿瘤细胞ES-2侵袭能力的影响。BC-A1作用于ES-2细胞,显著抑制ES-2细胞的侵袭。(4)体外抗增殖活性：首先用MTT实验和集落生成实验检测了BC-A1、吉西他滨、吉西他滨-bestatin(摩尔比1：1)、吉西他滨-bestatin (1:10)对肿瘤细胞的增殖抑制作用。实验发现,增加bestatin的浓度并不能显著增强抗增殖活性。多株肿瘤细胞的MTT实验证明,BC-Al对肿瘤的增殖抑制作用与吉西他滨相当。(5)体内抗增殖活性：通过昆明鼠皮下荷小鼠肝癌H22模型,测定了BC-A1的体内抗肿瘤作用。口服给药低剂量BC-A1对肿瘤的体内增殖具有良好的抑制作用,与静脉注射更高剂量吉西他滨取得了相当的疗效。(6)诱导凋亡活性：用流式细胞术检测发现,2μM的BC-A1作用于PLC/PRF/5细胞可以诱导肿瘤细胞凋亡。总之,BC-A1保留了对APN酶的抑制作用,抑制肿瘤新生血管生成和肿瘤的侵袭,能够在体内外有效抑制肿瘤细胞增殖,诱导凋亡。BC-A1口服有效,改善了吉西他滨的给药途径,具有良好的开发前景。
【关键词】：APN抑制剂 抗肿瘤 侵袭 血管生成 凋亡
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要10-13
• ABSTRACT13-16
• 符号说明16-19
• 第一章 前言19-30
• 第一节 氨肽酶N19-22
• 1.1 氨肽酶N的结构19-21
• 1.2 氨肽酶N的生物学功能21
• 1.3 氨肽酶N与肿瘤的关系21-22
• 第二节 氨肽酶N抑制剂22-25
• 2.1 APN抑制剂的结构设计22-23
• 2.2 APN抑制剂的研究进展23-25
• 第三节 APN靶向药物25-30
• 3.1 以NGR为配体的APN靶向药物25-27
• 3.2 以bestatin为配体的APN靶向药物BC-A127-30
• 3.2.1 吉西他滨概述27-28
• 3.2.2 吉西他滨结构改造28-30
• 第二章 APN抑制剂LJNK的抗肿瘤活性评价及机制研究30-59
• 第一节 化合物LJNK的合成30-34
• 1.1 化合物的合成路线31
• 1.2 化合物的合成步骤31-33
• 1.3 实验讨论33-34
• 第二节 APN抑制剂LJNK的抗肿瘤活性研究34-59
• 2.1 实验材料34-39
• 2.1.1 细胞株34
• 2.1.2 实验动物34
• 2.1.3 试剂34-35
• 2.1.4 试剂配制35-38
• 2.1.5 仪器设备38-39
• 2.2 试验方法39-46
• 2.2.1 LJNK与APN的分子对接39
• 2.2.2 人肿瘤细胞表面APN的表达39
• 2.2.3 APN酶活性测定39-40
• 2.2.4 HUVEC二维管形成实验40-41
• 2.2.5 大鼠主动脉环实验41
• 2.2.6 Transwell实验41
• 2.2.7 MTT实验41-42
• 2.2.8 集落生成实验42-43
• 2.2.9 昆明鼠皮下荷H22肿瘤模型43
• 2.2.10 细胞凋亡测试43-44
• 2.2.11 Western blotting实验44-45
• 2.2.12 Caspase活性测定45-46
• 2.2.13 数据处理46
• 2.3 实验结果46-56
• 2.3.1 分子对接结果46-47
• 2.3.2 LJNK对APN酶的抑制作用47-49
• 2.3.3 LJNK抑制血管生成作用49-51
• 2.3.4 LJNK抗侵袭作用51
• 2.3.5 LJNK体内外抗增殖活性51-53
• 2.3.6 LJNK毒性测试53-54
• 2.3.7 诱导肿瘤细胞凋亡测试54-56
• 2.4 讨论与结论56-59
• 第三章 BC-A1协同前药抗肿瘤活性评价59-67
• 1.1 实验材料59-60
• 1.1.1 细胞株59-60
• 1.1.2 实验动物60
• 1.1.3 试剂60
• 1.1.4 试剂配制60
• 1.1.5 仪器设备60
• 1.2 实验方法60-62
• 1.2.0 APN酶活性测定60-61
• 1.2.1 HUVEC二维管形成实验61
• 1.2.2 大鼠主动脉环实验61
• 1.2.3 抗侵袭作用61
• 1.2.4 MTT实验61
• 1.2.5 集落生成实验61
• 1.2.6 昆明鼠皮下荷H22肿瘤模型61-62
• 1.2.7 细胞凋亡测试62
• 1.2.8 数据处理62
• 1.3 实验结果62-66
• 1.3.1 BC-A1对APN酶的抑制作用62
• 1.3.2 BC-A1抑制血管生成作用62-63
• 1.3.3 BC-A1抗侵袭作用63
• 1.3.4 BC-A1体内外抗增殖活性63-65
• 1.3.5 BC-A1诱导肿瘤细胞凋亡活性65-66
• 1.4 讨论与结论66-67
• 总结与展望67-68
• 参考文献68-74
• 致谢74-75
• 攻读学位期间发表学术论文75-76
• 部分化合物~1H-NMR,~(13)C-NMR,HRMS图谱76-82
• 学位论文评阅及答辩情况表82

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