氯化甲基汞诱导的神经免疫炎症及α7烟碱型乙酰胆碱受体介导的抗炎作用

发布时间：2017-10-09 20:15

  本文关键词：氯化甲基汞诱导的神经免疫炎症及α7烟碱型乙酰胆碱受体介导的抗炎作用

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【摘要】：甲基汞可以引起神经免疫炎症反应,但其作用机理尚未阐明。小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞,被激活可释放多种细胞因子和炎症介质,影响慢性炎症引起的各种中枢神经系统疾病的病程和转归。α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7n ACh R)作为免疫细胞中胆碱能抗炎通路的关键分子,是调节小胶质细胞活化和抑制炎症发生的调控位点。研究目的:探讨氯化甲基汞(methylmercury chlorid,Me Hg Cl)神经免疫毒性作用机制及α7n ACh R抗炎通路的保护作用。研究方法:第一部分:甲基汞染毒模型的制备及烟碱的干预作用。实验动物随机分为对照组、模型组、N干预组和N组,每组10只。模型组Me Hg Cl染毒,N干预组和N组给予烟碱(nicotine,Nic)治疗,对照组给予等量生理盐水,共12周。应用免疫荧光法观察Nic对Me Hg Cl暴露大鼠海马齿状回(dentate gyrus,DG)α7n ACh R与Iba-1阳性细胞表达的影响;采用q RT-PCR技术检测Nic对Me Hg Cl暴露大鼠海马α7n ACh R m RNA的表达水平影响;采用Dot-Blot法测定海马IL-1β、IL-6和IL-10的水平;用ELISA法检测血清IL-1β水平。第二部分:甲基汞染毒细胞模型的制备及Nic和MLA的干预作用。采用Me Hg Cl暴露致BV2细胞和PC12细胞染毒模型为研究对象,观察Nic、甲基牛扁亭碱(methyllycaconitine,MLA)对Me Hg Cl暴露下BV2细胞和PC12细胞的影响。首先用MTT比色法动态观察不同浓度Me Hg Cl对细胞活力的影响。然后,将实验随机分为对照组、模型组、N干预组、M干预组、N组和M组。N干预组和M干预组分别给予Nic和MLA预处理后染毒,对照组给予等量PBS,处理12h、24h、48h后检测各项指标的改变。采用MTT法观察细胞活力的改变。通过ELISA法动态检测BV2细胞释放IL-1β、IL-6和IL-10水平的变化。采用q RT-PCR技术测定BV2细胞α7n ACh R、NF-κB(p65)和COX-2 m RNA表达水平,观察不同浓度Me Hg Cl对PC12细胞α7n ACh R m RNA表达水平的影响。采用细胞免疫组织化学法观察小胶质细胞α7n ACh R、EP3和p65蛋白,和PC12细胞α7n ACh R的表达。所有结果用?x±s表示。实验数据采用SPSS17.0软件分析,各组间比较用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,检验水准α=0.05,以P0.05表示有显著性差异。结果在体实验部分:1、Nic对Me Hg Cl暴露大鼠海马DG区α7n ACh R与Iba-1阳性细胞表达的影响。结果显示,与对照组相比,模型组α7n ACh R阳性细胞减少,特异性表达Iba-1的小胶质细胞增多,呈阿米巴样;与模型组比较,N干预组α7n ACh R阳性细胞和小胶质细胞数量明显增多,小胶质细胞轮廓清晰,有突起。2、Nic对Me Hg Cl暴露大鼠海马α7n ACh R m RNA表达水平的影响。结果显示,与对照组相比,模型组α7n ACh R m RNA明显降低(P0.001);与模型组相比,N干预组α7n ACh R m RNA水平显著上升(P0.001)。3、Me Hg Cl暴露对大鼠海马IL-1β、IL-6和IL-10的影响。与对照组相比,模型组IL-1β和IL-6含量明显升高(P0.001,P0.001),IL-10无显著差异(P0.05)。4、大鼠血清中IL-1β的影响。结果显示,与对照组相比,模型组血清中IL-1β明显升高(P0.001);与模型组相比,N干预组IL-1β水平显著下降(P0.001)。离体实验部分:5、Nic与MLA对Me Hg Cl处理下细胞活力的变化。Me Hg Cl可显著降低BV2和PC12细胞活力,并存在剂量依赖性(P0.05,P0.01,P0.001)和时间依赖性(P0.05,P0.01,P0.001)。与同一时间模型组相比,Nic与MLA干预组均可以不同程度改善细胞的存活率(P0.05,P0.01)。6、Nic与MLA对Me Hg Cl处理BV2细胞分泌炎症因子的影响。与对照组相比,Me Hg Cl暴露致IL-6和IL-10的分泌增多,在24h时达高峰(P0.05,P0.001);而在对应时间,N干预组和M干预组IL-6和IL-10水平均较模型组降低(P0.05,P0.001);IL-1β各时间点均无显著变化(P0.05)。7、胆碱能抗炎通路中相关因子m RNA水平的变化。①Me Hg Cl组COX-2 m RNA表达水平在12h上调(P0.05),随着暴露时间延长后,其表达水平迅速降低,在24h和48h其水平明显下降(P0.001)。Nic干预组和MLA干预组COX-2 m RNA表达水平在12h较模型组显著升高(P0.001),在24h和48h仍然保持高水平。②Me Hg Cl组p65m RNA表达水平在12h显著上升(P0.001),而Nic干预组和MLA干预组在12hp65m RNA表达水平显著抑制(P0.001)。③不同浓度Me Hg Cl对PC12细胞α7 n Ach R m RNA水平均有显著抑制作用(P0.001),Nic干预组和MLA干预组α7n Ach R m RNA水平明显升高(P0.001)。8、胆碱能抗炎通路中相关因子蛋白水平的变化。与对照组比较,Me Hg Cl处理BV2细胞12h引起p65蛋白核内表达升高;24hα7n ACh R表达降低(P0.01)和EP3表达增高(P0.01);与模型组比较,N干预组和M干预组α7n ACh R蛋白表达明显增强(P0.05),p65核内表达降低。Nic干预组EP3蛋白表达水平显著高于模型组(P0.001),而MLA干预组与对照组比较无明显变化。结论1、Me Hg Cl对BV2细胞和PC12细胞有直接细胞毒性作用,并存在时间依赖性和剂量依赖性,调控α7n ACh R可以抑制Me Hg Cl诱导的细胞凋亡。2、Me Hg Cl诱导神经免疫炎症与损害α7n ACh R介导的胆碱能抗炎信号通路的相关因子结构和功能有关。3、Nic和MLA调节α7n ACh R蛋白表达和基因转录水平,引起α7n ACh R胆碱能通路有关信号因子NF-κB(p65)、COX-2和EP3表达水平改变,发挥抗炎作用。
【关键词】：α7nAChR MeHgCl 小胶质细胞 胆碱能抗炎通路
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-12
• 英文缩写词表12-14
• 前言14-16
• 第一部分：在体观察MeHgCl诱导的免疫炎症及α7nAChR介导的抗炎作用16-28
• 实验材料及方法16-24
• 结果24-28
• 第二部分：离体观察MeHgCl诱导的神经免疫炎症以及α7nAChR介导的抗炎作用28-56
• 实验材料及方法28-41
• 结果41-56
• 讨论56-61
• 结论61-62
• 参考文献62-70
• 文献综述70-80
• 综述参考文献75-80
• 致谢80-81
• 攻读学位期间发表的学术论文81-82
• 个人简历82

【参考文献】

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1 张营丽;唐伟;;阿尔茨海默病的影响因素[J];中国实用神经疾病杂志;2012年19期

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本文编号：1002185