再生水中耐氯菌的消毒效果评价及其抗性机理初探

发布时间：2017-10-11 17:13

  本文关键词：再生水中耐氯菌的消毒效果评价及其抗性机理初探

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【摘要】：目的污水再生利用是缓解水资源短缺的有效途径,但再生水的生物安全性制约了其推广应用。氯消毒剂能够杀灭水中绝大部分微生物,广泛应用于再生水消毒,而有些细菌对氯消毒剂有一定的耐受性,这些耐氯菌作为一种新型生物污染物,是否影响再生水的生物安全及其耐氯性的产生机理尚不清楚。本研究针对天津市某大型再生水厂的出厂水,分离耐氯菌并对其消毒效果和耐氯机理进行了初步研究。方法本研究针对天津市某大型再生水厂的出厂水,以大肠杆菌8099作为对照,通过静态消毒试验,掌握再生水中耐氯性细菌的污染水平。利用最小抑菌浓度实验找出在氯消毒作用下仍可以生长的细菌,并对混合菌样进行分离纯化,以分子生物学方法和生化反应进行微生物种属鉴定并分析再生水中耐氯菌的种群结构,阐明耐氯菌的种属特性。根据耐氯菌种属选择相应标准菌株,评价分离菌和标准菌的氯消毒效果,以及环境因素对消毒效果的影响。用滤膜法收集消毒前后的芽孢。利用光学显微镜和电子显微镜比较消毒前后分离菌和标准菌形态上的表观差异和超微结构差异。通过蛋白质电泳分析、比较氯消毒前后分离菌和标准菌芽孢在蛋白水平变化的差异。荧光染色分析芽孢衣壳破损程度。结果同样氯消毒剂浓度下,再生水中细菌杀灭率低于大肠杆菌8099。经最小抑菌浓度实验得到耐氯性高于大肠杆菌8099的细菌,菌群分析均属于枯草芽孢杆菌。对耐氯菌进行分离纯化,得到5株表观性状不同的菌株,经鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)。对其中一株枯草芽孢杆菌BS4和枯草芽孢杆菌标准菌株ATCC9372进行氯灭活实验,繁殖体状态下,0.3mg/L、1.0mg/L有效氯对两株菌的杀灭率差异有统计学意义,芽孢状态下,3.0mg/L、6.0mg/L和9.0mg/L有效氯浓度下,两株菌的杀灭率差异有统计学意义。低pH和高水温可以促进氯的消毒效果效果。通过透射电镜观察到消毒前芽孢结构清晰,表面平滑,BS4比ATCC9372具有更薄的外衣壳和更厚的内衣壳;消毒后,ATCC9372衣壳损坏严重,可见内容物浑浊、衣壳缺损及失去内容物后的衣壳残留,BS4未见明显衣壳缺损,可见衣壳褶皱,内外衣壳相互剥离,外衣壳局部膨出或断裂。通过荧光显微镜观察到相同消毒剂水平作用下,BS4芽孢破损程度低于ATCC9372,芽孢杀灭率与芽孢衣壳破损程度有关。蛋白质电泳结果显示BS4与ATCC937在芽孢衣壳和芽孢细胞的蛋白质种类和水平均存在差异,消毒前后两株菌的蛋白水平变化有差异,可能与二者耐氯性不同有关。结论用MIC方法可以筛选出再生水中的耐氯菌,经鉴定均为芽孢杆菌属;氯消毒实验表明分离菌BS4的耐氯性高于对照菌株ATCC9372;芽孢衣壳结构不同和芽孢蛋白组成及含量的差异是BS4的耐氯机制之一。本研究首次在再生水中分离出耐氯枯草芽孢杆菌,对其耐氯性产生的机制进行了初步探讨,研究结果将会为保障再生水生物安全提供理论依据,为再生水的安全推广应用奠定基础。
【关键词】：再生水 枯草芽孢杆菌 耐氯性 机理
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R123.6
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 缩略语12-13
• 前言13-17
• 研究现状、成果13-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、再生水中耐氯菌的检测17-24
• 1.1 对象和方法17-19
• 1.1.1 实验试剂17-18
• 1.1.2 实验仪器设备18
• 1.1.3 实验菌株18
• 1.1.4 水样的采集18
• 1.1.5 理化指标检测18-19
• 1.1.6 微生物指标检测19
• 1.1.7 水样最小抑菌浓度检测19
• 1.1.8 杀菌效果实验19
• 1.2 结果19-21
• 1.2.1 再生水理化及微生物指标检测结果19-20
• 1.2.2 水样最小抑菌浓度检测结果20
• 1.2.3 氯对再生水杀菌效果实验20-21
• 1.3 讨论21-23
• 1.3.1 再生水的理化和微生物指标21-22
• 1.3.2 再生水的最小抑菌浓度22
• 1.3.3 氯对再生水的杀菌效果22-23
• 1.4 小结23-24
• 二、耐氯菌的种属鉴定、表观形态和培养特性24-35
• 2.1 对象和方法24-26
• 2.1.1 试剂和材料24
• 2.1.2 仪器设备24-25
• 2.1.3 标准菌株25
• 2.1.4 耐氯菌的纯化25
• 2.1.5 耐氯菌的表观性状25
• 2.1.6 耐氯菌的生化鉴定25
• 2.1.7 耐氯菌的基因提取25
• 2.1.8 耐氯菌的分子生物学检测和种属鉴定25-26
• 2.1.9 耐氯菌菌群分析26
• 2.1.10 耐氯菌生长曲线的测定26
• 2.1.11 耐氯菌芽孢染色26
• 2.2 结果26-33
• 2.2.1 单菌落纯化结果26-27
• 2.2.2 菌株生化鉴定结果27
• 2.2.3 菌株分子生物学鉴定结果27
• 2.2.4 耐氯菌菌群分析结果27-31
• 2.2.5 枯草芽孢杆菌染色结果31-32
• 2.2.6 枯草芽孢杆菌生长曲线测定32-33
• 2.3 讨论33-34
• 2.4 小结34-35
• 三、耐氯菌的消毒效果评价35-46
• 3.1 对象和方法35-37
• 3.1.1 试剂和材料35
• 3.1.2 仪器设备35-36
• 3.1.3 实验菌株36
• 3.1.4 芽孢的制备36
• 3.1.5 有效氯浓度测定36
• 3.1.6 氯对枯草芽孢杆菌繁殖体的消毒效果36
• 3.1.7 氯对枯草芽孢杆菌芽孢的消毒效果36-37
• 3.1.8 灭活率计算37
• 3.1.9 环境因素对氯灭活芽孢效果的影响37
• 3.2 结果37-42
• 3.2.1 有效氯浓度测定方法建立37
• 3.2.2 氯对枯草芽孢杆菌繁殖体的消毒效果37-39
• 3.2.3 不同氯浓度灭活水中芽孢效果评价39-41
• 3.2.4 水温对氯灭活芽孢效果影响41
• 3.2.5 pH对氯灭活芽孢效果影响41-42
• 3.3 讨论42-45
• 3.3.0 枯草芽孢杆菌黑色变种ATCC 937242-43
• 3.3.1 氯对枯草芽孢杆菌繁殖体的杀灭效果43
• 3.3.2 氯对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果43-45
• 3.3.3 水温对氯消毒杀灭枯草芽孢杆菌芽孢的效果影响45
• 3.3.4 pH对氯消毒杀灭枯草芽孢杆菌芽孢的效果影响45
• 3.4 小结45-46
• 四、耐氯性枯草芽孢杆菌芽孢的抗性机理初探46-63
• 4.1 对象和方法46-52
• 4.1.1 试剂和材料46-47
• 4.1.2 仪器设备47-48
• 4.1.3 芽孢的回收48-49
• 4.1.4 透射电镜观察耐氯菌的细胞形态49
• 4.1.5 芽孢荧光染色观察49
• 4.1.6 芽孢表面疏水性检测49-50
• 4.1.7 芽孢脱衣壳处理50-51
• 4.1.8 芽孢细胞裂解51
• 4.1.9 芽孢蛋白SDS-PAGE电泳分析51-52
• 4.2 结果52-59
• 4.2.1 芽孢洗脱液的选择52
• 4.2.2 芽孢表面疏水性分析52-53
• 4.2.3 荧光染色结果53-55
• 4.2.4 TEM结果55
• 4.2.5 芽孢蛋白提取55-57
• 4.2.6 芽孢蛋白SDS-PAGE电泳结果57-59
• 4.3 讨论59-62
• 4.3.1 芽孢荧光染色59-60
• 4.3.2 芽孢超微结构的变化60
• 4.3.3 芽孢蛋白差异60-62
• 4.4 小结62-63
• 结论63-64
• 参考文献64-70
• 发表论文和参加科研情况说明70-71
• 综述 消毒剂抗性菌的研究进展71-79
• 综述参考文献76-79
• 致谢79-80
• 个人简历80

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