巨噬细胞对贫铀颗粒的吞噬及吞噬后上清对支气管上皮细胞的作用研究

发布时间：2017-10-12 09:44

  本文关键词：巨噬细胞对贫铀颗粒的吞噬及吞噬后上清对支气管上皮细胞的作用研究

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【摘要】：目的 建立肺巨噬细胞吞噬贫铀（DU）颗粒的细胞模型，模拟人肺吸入DU颗粒后的吞噬廓清过程，观察DU颗粒吞噬消解规律及在此过程中巨噬细胞的损伤效应，并对该效应致支气管上皮细胞的作用进行研究，为贫铀武器的损伤和医学防护提供依据。 方法 以巨噬细胞（AM）为研究对象，采用难溶性贫铀颗粒进行染毒。应用透射电镜观察巨噬细胞吞噬铀颗粒的情况；采用酶联免疫分析法测定吞噬过程中酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LZP）的变化；采用湿消化法测定巨噬细胞吞噬铀颗粒后上清中可溶性铀含量变化，明确AM对DU消化溶解的能力；通过液体悬浮芯片技术测定细胞培养上清IL-1β、IL-10、IL-6、GM-CSF、IL-5、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、 IL-8等细胞因子的含量；采用CCK-8法测定巨噬细胞存活；化学/荧光发光仪检测细胞内活性氧变化，Griess Reagent法检测活细胞内活性氮（NO），DTNB法检测谷胱甘肽水平改变。 采用吞噬DU颗粒的巨噬细胞培养上清作用于人支气管上皮细胞系BEP-2D，通过CCK-8法测定支气管上皮细胞BEP-2D存活、化学/荧光发光仪检测支气管上皮细胞BEP-2D细胞内活性氧变化，模拟人肺巨噬细胞吞噬DU颗粒后对支气管上皮细胞的作用。 结果 1、透射电镜下观察到，低浓度染毒时DU颗粒被一单层溶酶体膜包裹着，说明该颗粒是在溶酶体内被吞噬消化的，但随颗粒浓度的增加到40μg/cm2时，大量的DU颗粒便聚集在细胞内，并以空泡状存在巨噬细胞中，提示DU颗粒过多，超出溶酶体吞噬消化的能力。 2、巨噬细胞经DU染毒后，细胞内ACP酶含量随时间及浓度的增加，，ACP酶的含量呈总体下降趋势；而LZP酶含量随时间与浓度的增加无上升或下降趋势，表明巨噬吞噬消化DU颗粒时消耗ACP酶。 3、巨噬细胞经DU染毒后，4小时后与正常对照组相比，上清中可溶性铀含量显著增加。12小时后，巨噬细胞上清中可溶性铀含量细胞达到高峰，24小时后巨噬细胞上清液中可溶性铀与12小时相比时没有显著升高，这可能是由于巨噬细胞吞噬DU颗粒的作用达到饱和，也可能是由于DU损伤巨噬细胞，导致吞噬能力下降，从而降低了对DU颗粒的消化溶解。 4、巨噬细胞经DU染毒后，巨噬细胞存活率显著下降，而细胞上清中IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-8等炎性细胞因子明显增加，同时细胞内活性氧、活性氮上升，谷胱甘肽下降；以上结果表明，DU颗粒可能是通过产生炎症因子及氧化应激机制来损伤巨噬细胞。 5、BEP-2D细胞经吞噬DU颗粒后的巨噬细胞上清作用后，与正常上清组比较，BEP-2D细胞存活率显著下降、ROS上升，提示巨噬细胞吞噬DU后释放可损伤BEP-2D的物质。 结论 DU经巨噬细胞吞噬后在溶酶体中被溶解消化成可溶性铀，并通过氧化应激这一机制损伤巨噬细胞；经DU刺激巨噬细胞的上清作用于BEP-2D，可导致BEP-2D损伤。
【关键词】：贫铀 巨噬细胞 吞噬 可溶性铀
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-14
• 第一部分 THP-1 巨噬细胞的培养与鉴定14-20
• 1．实验材料14-15
• 1.1 主要试剂及耗材14
• 1.2 仪器与设备14-15
• 1.3 主要试剂在配置15
• 2．实验方法15-17
• 2.1 THP-1 细胞细胞培养，传代15
• 2.2 THP-1 细胞的冻存与复苏15-16
• 2.3 THP-1 巨噬细胞的鉴定16-17
• 3．结果17-18
• 3.1 经 PMA 诱导分化后光镜下细胞形态17
• 3.2 免疫荧光法细胞染色后变化17-18
• 讨论18-20
• 第二部分 巨噬细胞对 DU 颗粒的吞噬20-36
• 1．实验材料21-22
• 1.1 主要试剂及耗材21
• 1.2 仪器与设备21
• 1.3 主要试剂配置21-22
• 2．实验方法22-25
• 2.1 巨噬细胞的存活率22
• 2.2 透射电镜观察巨噬细胞的吞噬22-23
• 2.3 酸性磷酸酶的检测23
• 2.4 溶菌酶的检测23
• 2.5 巨噬细胞上清中可溶性铀的测定23-24
• 2.6 上清中细胞因子测定24
• 2.7 巨噬细胞内外活性氧的检测24
• 2.8 巨噬细胞内 NO 的测定24-25
• 2.9 巨噬细胞内 GSH 检测25
• 2.10 统计分析25
• 3．结果25-31
• 3.1 细胞存活实验25-26
• 3.2 透射电镜观察巨噬细胞的吞噬26
• 3.3 巨噬细胞上清与细胞内的酸性磷酸酶26-27
• 3.4 巨噬细胞上清与细胞内的溶菌酶27-28
• 3.5 巨噬细胞上清中可溶性铀含量28-29
• 3.6 DU 颗粒诱导的巨噬细胞因子29-30
• 3.7 贫铀诱发巨噬细胞 ROS、NO 的增高，GSH 的下降30-31
• 4． 讨论31-36
• 4.1 巨噬细胞吞噬 DU 颗粒31-32
• 4.2 肺巨噬细胞吞噬 DU 颗粒后引起可溶性铀的释放32
• 4.3 DU 颗粒促使炎症因子分泌32-34
• 4.4 DU 颗粒引起巨噬细胞存活下降34-36
• 第三部分 巨噬细胞吞噬贫铀颗粒后上清中细胞因子对 BEP-2D 细胞的影响36-41
• 1．实验材料36
• 1.1 主要试剂及耗材36
• 1.2 仪器与设备36
• 1.3 主要试剂在配置36
• 2．实验分组36-37
• 3．实验方法37-38
• 3.1 BEP-2D 细胞存活率的测定37
• 3.2 BEP-2D 细胞内外活性氧的探测37-38
• 4．结果38-40
• 4.1 BEP-2D 细胞存活率38-39
• 4.2 BEP-2D 细胞 ROS 的释放39-40
• 讨论40-41
• 结论41-42
• 参考文献42-47
• 综述：贫铀细胞毒性的研究进展47-54
• 参考文献51-54
• 硕士期间发表的论文54-55
• 英文缩写词索引55-56
• 致谢56-58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1018029