农药、塑化剂与蛋白质的结合机理研究

发布时间：2017-10-12 14:15

  本文关键词：农药、塑化剂与蛋白质的结合机理研究

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【摘要】：近年来,由于农药和塑化剂在农业和工业生产过程中的大量应用以及不受控制和不合理的使用,这两类重要化学污染物对食品安全和人类健康产生的不利影响引起越来越多的关注。蛋白质作为生命体的必要组成成分,其结构的变化可能会造成生命体产生结构性或功能性的损伤,导致某些疾病。污染物小分子通过直接或间接途径进入机体后,可能会对机体蛋白质产生毒性作用,诱导蛋白质结构发生变化,进而影响蛋白质的生物学功能。本文以人血清白蛋白和胰蛋白酶为蛋白模型,运用多种光谱学手段结合分子模拟等技术研究了农药扑草净以及几种邻苯二甲酸酯类塑化剂与蛋白质的结合机制,探讨了这几种化学污染物对蛋白质结构功能的影响。本研究对从分子水平上了解污染物小分子在体内的分布、转运、代谢及毒性作用提供重要信息。本文主要内容如下:1.简要介绍了蛋白质的结构、功能及生物学性质,同时对小分子与蛋白质相互作用的主要研究方法进行了概述。2.运用多种光谱学方法包括荧光光谱法、紫外-可见吸收光谱法、圆二色谱法和红外光谱法结合分子模拟技术,在模拟生理条件下(pH 7.4)研究了扑草净与人血清白蛋白(HSA)的结合特性以及蛋白质结构的变化。荧光数据显示扑草净对HSA的荧光猝灭为静态猝灭过程,两者之间的结合常数达103数量级,说明扑草净与HSA具有中等强度的结合能力。负的焓变值和正的熵变值表明扑草净与HSA的结合过程主要由疏水作用和氢键驱动。位点竞争实验显示扑草净的结合位点为site I,分子模拟结果显示,扑草净结合在HSA亚域IIA的疏水空腔,即site I,证实了位点竞争实验结果。紫外-可见吸收光谱、同步荧光光谱、圆二色谱和红外光谱分析表明,扑草净的加入导致HSA多肽链部分伸展,结构发生变化,α-螺旋含量降低伴随着β-折叠、β-转角和无规则卷曲含量的增加。3.采用多种光谱方法和分子模拟技术测定了塑化剂邻苯二甲酸二正辛酯(DnOP)和邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)与HSA的相互作用模式。结果表明,DnOP和DEHP对HSA内源荧光的猝灭机制为形成复合物的静态猝灭,疏水作用和氢键为主要作用力,DEHP与HSA的亲和力略强于DnOP。DnOP和DEHP均结合于HSA亚结构域IIA(site I位),导致HSA二级结构发生变化,降低了HSA的α-螺旋的含量,并且DEHP诱导HSA多肽链的伸展程度强于DnOP。蛋白质表面疏水性研究发现两种塑化剂的结合导致蛋白质表面疏水性增加,即蛋白质疏水空腔的暴露程度增加。同时,以吖啶橙(AO)作为荧光探针,通过优化实验条件,利用荧光光谱法对DnOP和DEHP进行定量分析,AO的荧光强度差值与DnOP和DEHP含量在1.20-11.76×10-5 mol L 1范围内呈良好线性关系,检出限分别为1.15×10-5 mol L 1和1.02×10-5 mol L 1。4.在模拟人体生理条件下(pH 7.4),应用荧光光谱法、紫外光谱法和圆二色谱法并结合原子力显微镜和分子模拟技术,研究了邻苯二甲酸二甲酯(DMP)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对胰蛋白酶的光谱性质、结构及催化活性的影响。DMP和DBP通过与胰蛋白酶结合形成基态复合物而猝灭胰蛋白酶的内源荧光,且在胰蛋白酶上都只有一个结合位点。298 K时,两者与胰蛋白酶相互作用的结合常数分别为3.92×103 L mol-1和4.94×103 L mol-1,DBP与胰蛋白酶的亲和能力略强于DMP。同步荧光光谱、紫外光谱、圆二色谱和红外光谱分析表明,DMP、DBP的加入均导致酶构象发生变化,蛋白质多肽链重排。分子模拟和酶活性测定结果显示,DMP、DBP主要与胰蛋白酶的催化三联体(His57,Asp102和Ser195)发生相互作用,导致酶活性被抑制。原子力显微镜图像显示,DMP、DBP的存在引起胰蛋白酶的表面形态发生变化,蛋白质发生聚集。在pH 7.0的BR缓冲液中,DMP、DBP的荧光强度与浓度之间存在线性关系,线性范围为3.32-47.62×10 7mol L-1,DMP和DBP的检出限分别为1.58×10 7 mol L-1和2.43×10 7 mol L 1。
【关键词】：扑草净 塑化剂 人血清白蛋白 胰蛋白酶 结合机理 光谱学方法
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 缩写符号与代号11-12
• 第1章 绪论12-23
• 1.1 引言12-13
• 1.2 蛋白质概述13-17
• 1.2.1 蛋白质的结构13-14
• 1.2.2 蛋白质的功能14-15
• 1.2.3 人血清白蛋白的结构与功能15-16
• 1.2.4 胰蛋白酶的结构与功能16-17
• 1.3 小分子与蛋白质相互作用研究方法17-20
• 1.3.1 光谱学方法17-19
• 1.3.2 电化学分析方法19-20
• 1.3.3 原子力显微镜20
• 1.3.4 分子模拟20
• 1.4 选题意义与研究内容20-23
• 1.4.1 立题思路及选题意义20-22
• 1.4.2 研究内容22-23
• 第2章 农药扑草净与人血清白蛋白的结合机理研究23-36
• 2.1 引言23-24
• 2.2 实验部分24-26
• 2.2.1 实验仪器与材料24
• 2.2.2 实验方法24-26
• 2.3 结果与讨论26-35
• 2.3.1 扑草净对HSA的荧光猝灭机制26-28
• 2.3.2 热力学参数和作用力类型的确定28
• 2.3.3 荧光标记竞争实验28-29
• 2.3.4 扑草净对HSA二级结构影响分析29-33
• 2.3.5 分子模拟研究33-35
• 2.4 本章小结35-36
• 第3章 DnOP和DEHP与人血清白蛋白相互作用的光谱学研究36-56
• 3.1 引言36-37
• 3.2 实验部分37-39
• 3.2.1 仪器与试剂37-38
• 3.2.2 实验方法38-39
• 3.3 结果与讨论39-54
• 3.3.1 DnOP/DEHP对HSA的荧光猝灭39-41
• 3.3.2 热力学参数和作用力类型41
• 3.3.3 结合位点的确定41-45
• 3.3.4 DnOP/DEHP对HSA表面疏水性的影响45-47
• 3.3.5 DnOP/DEHP诱导HSA结构变化47-51
• 3.3.6 AO荧光猝灭法测定DnOP和DEHP51-54
• 3.4 本章小结54-56
• 第4章 DMP和DBP与胰蛋白酶的作用机制研究56-75
• 4.1 引言56-57
• 4.2 实验部分57-58
• 4.2.1 主要仪器与试剂57
• 4.2.2 实验方法57-58
• 4.3 结果与讨论58-73
• 4.3.1 DMP/DBP诱导胰蛋白酶荧光猝灭58-60
• 4.3.2 结合常数和结合位点数60-61
• 4.3.3 结合位点的确定61-63
• 4.3.4 热力学参数与作用力63
• 4.3.5 DMP和DBP对胰蛋白酶活性的影响63-64
• 4.3.6 胰蛋白酶表面形态的变化64-66
• 4.3.7 DMP和DBP对胰蛋白酶结构的影响66-71
• 4.3.8 DMP和DBP的定量分析71-73
• 4.4 本章小结73-75
• 第5章 结论与展望75-77
• 5.1 结论75-76
• 5.2 展望76-77
• 致谢77-78
• 参考文献78-87
• 攻读硕士期间的研究成果87

【参考文献】

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1 王腾;何晓囡;董颖;张志红;郭晓燕;相秉仁;;布南色林与人血清白蛋白相互作用的光谱学研究[J];分析试验室;2012年01期

2 林兴桃,王小逸,任仁;环境内分泌干扰物——邻苯二甲酸酯的研究[J];环境污染与防治;2003年05期

3 解玮,蒋颂辉,屈卫东,朱惠刚;DEHP、DBP内分泌干扰活性的实验研究[J];中国环境科学;2004年01期

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1 豆换敬;分子光谱法研究血红蛋白和小分子的相互作用[D];郑州大学;2014年

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本文编号：1019151