饮用水中亚硝胺和微囊藻毒素联合作用与食管癌的关系研究

发布时间：2017-10-16 05:04

  本文关键词：饮用水中亚硝胺和微囊藻毒素联合作用与食管癌的关系研究

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【摘要】：目的：近年来,由于我国广泛的工业污染以及农药、化肥的过度使用,造成地面水体中含氮化合物的增加、水体富营养化进而导致藻类的过度繁殖。含较高含量含氮化合物的水源水经过集中式供水氯化消毒处理后可产生饮用水中亚硝胺类消毒副产物(nitrosamines,NAms),研究表明,NAms在原水、出厂水、管网末梢水中均可检出且其浓度逐渐升高。微囊藻毒素(Microcystin)也可在原水中检出,且自来水厂常规处理工艺不能使其完全消除,原水处理后仍可检出。因此,人群可经饮水长期持续暴露于亚硝胺类消毒副产物和微囊藻毒素。在饮用水中亚硝胺类消毒副产物和微囊藻毒素等化学物的低浓度、长期和联合作用下,可能增加常规处理工艺的集中供水人群的致癌风险。本研究以甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒F-344大鼠,探讨两毒物在食管癌癌前病变发生中的联合作用；并进一步应用甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒正常食管上皮HET-1A细胞和食管癌EC109细胞,观察其与食管癌发生发展的影响；初步明确甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒使食管上皮细胞发生恶性转化参与调控的信号转导通路。方法和结果：1、甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒诱发大鼠癌前病变实验本研究将雄性F-344大鼠分为对照组、NMBzA单独染毒组、MC-LR单独染毒组及联合染毒组四组进行染毒处理,每周3次,隔天一次,共5周。染毒结束后分别在19、22、25和28周依次处死联合染毒组大鼠,一次3只,观测大鼠癌变情况。到31周时处死全部动物。大鼠处死后取食管中段组织以10%福尔马林固定4h,经常规石蜡包埋HE染色后送病理检查。结果显示：25周后可观测到大鼠食管发生增生且随时间延长增生加重。31周时,空白组和MC-LR单独染毒组均未观测到有病变发生；NMBzA单独染毒组增生率为60%,其中40%为轻度增生,20%为中度增生；联合染毒组增生率为100%,其中25%为轻度增生,62.5%为中度增生,12.5%为重度增生。表明甲基苄基亚硝胺单独染毒可以诱发癌前病变,微囊藻毒素单独染毒不能诱发癌前病变,但是可以作为促进剂与甲基苄基亚硝胺协同诱导食管癌癌前病变的发生。2、甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒对食管癌发生发展的影响2.1甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒诱发正常食管上皮HET-1A细胞恶性转化2.1.1甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒的联合作用研究(1)收集处于对数生长期的HET-1A分为四组,阴性对照组、NMBzA (11nmol/L、 10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1mmol/L)单独染毒组、MC-LR (1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L)单独染毒组及各浓度联合染毒组成的联合染毒组,染毒24h后采用MTT实验得到甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素单独及联合染毒24h的细胞抑制率结果。结果显示,NMBzA单独染毒时,随浓度增加其抑制率显著增加(P0.05)；MC-LR单独染毒时,MC-LR抑制率先降低后增加(P0.05)；NMBzA与MC-LR联合染毒组抑制率随着浓度升高先降低再增加(P0.05)。(2)应用析因设计方差分析结果显示,不同染毒剂量NMBzA与MC-LR均对细胞抑制率有影响(P0.05),NMBzA随染毒剂量增加抑制率也增加；MC-LR与NMBzA两毒物有交互作用(P0.05),NMBzA 1mmol/L和MC-LR 10μmol/L时抑制率最高。(3)应用中效原理判断两毒物联合作用类型,结果显示,当fa0.23时,CI1,两毒物联合产生拮抗效应；当fa0.23时,CI1,两毒物联合产生协同效应。2.1.2甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素单独及联合染毒20代对HET-1A细胞克隆形成能力的影响收集染毒20代后的HET-1A细胞计数后种入六孔板中进行平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验,结果显示,NMBzA与MC-LR存在交互作用,NMBzA与MC-LR均可使细胞克隆形成率增加,差异有统计学意义,而联合染毒组克隆形成率高于NMBzA和MC-LR单独染毒组,提示NMBzA与MC-LR可协同促进细胞恶性转化。2.1.3甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素单独及联合染毒20代对HET-1A细胞生物学功能的影响收集染毒20代后的HET-1A细胞,分析两毒物单独及联合染毒细胞周期、凋亡、迁移及侵袭能力的改变。(1)利用流式细胞术(PI染色)检测NMBzA与MC-LR单独及联合染毒24h后细胞周期的改变。结果显示,NMBzA与MC-LR具有交互作用,NMBzA与MC-LR单独染毒组及联合染毒组均表现为G1期缩短,S期和G2期延长,差异有统计学意义。提示细胞可能阻滞在S期,DNA合成增加,增殖失控。(2)利用流式细胞术(Annexin V-FITC标记)检测NMBzA与MC-LR单独及联合染毒24h后细胞凋亡率。结果显示,NMBzA单独染毒组促进细胞凋亡,差异有统计学意义。NMBzA与MC-LR联合染毒对细胞凋亡的影响没有交互作用。(3)采用Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力,结果显示,NMBzA 与 MC-LR具有交互作用,MC-LR可促进细胞迁移,差异均有统计学意义。NMBzA与MC-LR 均可促进细胞侵袭,差异均有统计学意义,提示NMBzA与MC-LR可协同促进细胞侵袭。2.2甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒对食管癌EC109细胞恶性表型的影响根据HET-1A细胞得到的两毒物联合作用结果,分别设立低、中、高三个剂量组单独及联合染毒EC109细胞24h,检测不同剂量两毒物单独及联合染毒对EC109细胞周期、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。(1)利用流式细胞术(PI染色)检测NMBzA与MC-LR单独及联合染毒24h后细胞周期的改变。结果显示,与对照组相比,各染毒组细胞G1期缩短,S期延长(P0.05),表明细胞阻滞在S期,出现了一定程度的增殖失控。(2)利用流式细胞术(Annexin V-FITC标记)检测NMBzA与MC-LR单独及联合染毒24h后细胞凋亡率。低剂量组对细胞凋亡无显著改变,中剂量组NMBzA与MC-LR联合抑制细胞凋亡(P0.05),高剂量组NMBzA与MC-LR联合促进细胞凋亡(P0.05)。(3)使用Transwell小时检测细胞迁移和侵袭能力,低剂量组细胞迁移和侵袭能力无显著改变,中、高剂量组MC-LR和NMBzA协同促进细胞迁移和侵袭(P0.05)。3、甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒对]HET-1A细胞的恶性转化机制研究3.1不同食管细胞内OATP1B1和OATP1B3的表达情况收集己染毒10代和20代的HET-1A细胞,应用实时荧光定量PCR技术测定OATP1B1和OATP1B3在不同食管细胞内mRNA表达情况。实验结果显示,有机阴离子转运肽OATP1B1和OATP1B3在食管正常上皮细胞和食管癌细胞中都有表达,与正常食管上皮细胞HET-1A相比,OATP1B1在食管癌细胞C17、EC109、EC9706内表达均增加(P0.05)；OATP1B3在食管癌细胞EC109、EC9706内表达均增加(P0.05)。3.2甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒调控信号通路节点基因PP2A和Ras基因的表达采用实时荧光定量PCR技术对已染毒10代和20代的HET-1A细胞内调控通路节点基因PP2A和Ras基因的mRNA表达水平进行检测。(1)对于PP2A基因,染毒10代时尚不能认为NMBzA与MC-LR存在交互作用,NMBzA单独染毒促进PP2A表达,差异有统计学意义,染毒20代时NMBzA与MC-LR存在交互作用,NMBzA单独染毒促进PP2A表达,MC-LR单独染毒抑制PP2A表达,差异均有统计学意义。(2)对于Ras基因,染毒10代时可以认为NMBzA与MC-LR存在交互作用,NMBzA单独染毒促进Ras表达,差异有统计学意义,染毒20代时NMBzA与MC-LR也存在交互作用,NMBzA与MC-LR单独染毒均促进Ras基因表达,差异均有统计学意义,且联合染毒组Ras表达明显高于两毒物的表达,提示两毒物可协同促进Ras基因的表达。3.3甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒信号通路分析应用Western Blotting半定量技术测定己染毒10代和20代的HET-1A细胞内MAPK家族成员ERK、JNK和P38MAPK,MAPK下游转录因子ELK1和c-Myc,P53通路中细胞周期相关蛋白P53、Cdc25C和Cdc2以及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的蛋白表达及其磷酸化水平表达。(1)ERK蛋白的磷酸化表达水平在MC-LR单独染毒组明显升高,并且随着MC-LR染毒代数的增加呈现出依赖性,在NMBzA单独染毒组和联合染毒组先降低后增加,在联合染毒组表达最高,差异有统计学意义；JNK蛋白的磷酸化水平随染毒代数增加而增加,在20代的联合染毒组表达最高,差异有统计学意义；P38 MAPK蛋白的磷酸化水平随染毒代数增加呈降低趋势；提示NMBzA和MC-LR联合染毒可以通过激活ERK和JNK蛋白的磷酸化激活MAPK通路。(2)ELK1蛋白的磷酸化水平随染毒代数增加先降低后增加,在20代的联合染毒组表达最高,差异有统计学意义；c-Myc在MC-LR单独染毒组和联合染毒组磷酸化水平均随染毒代数增加而增加,差异有统计学意义。表明联合染毒组确实可以激活MAPK通路及其下游转录因子,促进细胞恶性转化。(3)对于P53基因的mRNA表达,染毒10代时尚不能认为NMBzA与MC-LR存在交互作用,染毒20代时NMBzA与 MC-LR存在交互作用,NMBzA与MC-LR均促进P53表达,差异均有统计学意义,但联合染毒组P53表达明显降低,提示两毒物可协同抑制P53基因的表达,P53 (Ser37)蛋白表达也与mRNA表达结果一致。Cdc25C蛋白的磷酸化水平在联合染毒组中随染毒代数增加而增加,在20代的联合染毒组中表达最高,差异有统计学意义；磷酸化的Cdc2蛋白(Ser37)表达水平均随染毒代数增加而降低,差异有统计学意义。提示NMBzA和MC-LR联合染毒引起细胞阻滞,DNA合成增加,使细胞周期呈现出一定程度的增殖失控。(4)Bcl-2蛋白表达量、Bax蛋白表达量及Bcl-2/Bax比值均随染毒代数增加而增加,差异有统计学意义。提示细胞凋亡趋势逐渐减弱,从而促进细胞恶性转化。结论：1.甲基苄基亚硝胺单独染毒可以诱发F344大鼠出现癌前病变,微囊藻毒素单独染毒无法诱发癌前病变,但可在甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒中发挥促癌剂作用促进甲基苄基亚硝胺的食管癌癌前病变作用。2.甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合低剂量具有拮抗效应,高剂量具有协同效应。甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素可协同促进正常食管上皮细胞HET-1A细胞发生恶性转化。甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素可协同将细胞阻滞在S期,使细胞增殖失控；NMBzA促进细胞凋亡；MC-LR可促进细胞迁移；NMBzA与MC-LR可协同促进细胞侵袭。3.不同剂量甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素染毒食管癌细胞时,可协同将细胞阻滞在S期,使细胞增殖失控；中剂量组联合抑制细胞凋亡,高剂量组NMBzA与MC-LR联合促进细胞凋亡；NMBzA与MC-LR可协同促进细胞迁移和侵袭。4.有机阴离子转运肽OATP1B1和OATP1B3在食管正常上皮细胞和食管癌细胞中都有表达,与正常食管上皮细胞HET-1A相比,OATP1B1在食管癌细胞C17、EC109、 EC9706内表达均增加；OATP1B3在食管癌细胞EC109、EC9706内表达均增加。5.与对照组相比,甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素单独及联合染毒组PP2A表达降低,Ras表达增加。表明NMBzA和MC-LR联合染毒可以通过抑制PP2A表达和促进Ras表达激活下游信号转导通路促进细胞恶性转化。6.甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒可以通过激活MAPK通路,促进MAPK下游转录因子ELK1和c-Myc的表达；抑制P53的表达,促进Cdc25C蛋白的表达,抑制Cdc2蛋白表达使细胞阻滞,DNA合成增加,细胞增殖失控。Bcl-2蛋白表达量、Bax蛋白表达量及Bcl-2/Bax比值均随染毒代数增加而增加,凋亡趋势逐渐减弱,从而促进细胞恶性转化。
【关键词】：亚硝胺 微囊藻毒素 食管癌 联合作用
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R123
【目录】：

• 中文摘要5-10
• ABSTRACT10-17
• 缩略词表17-19
• 前言19-22
• 第一章 甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒诱发大鼠致癌实验22-27
• 1 材料和方法22-23
• 2 结果23-25
• 3 讨论25-27
• 第二章 甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒对食管癌发生发展的影响27-43
• 第一节 甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒诱发正常食管上皮HET-1A细胞恶性转化27-37
• 第二节 甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒对食管癌EC109细胞恶性表型的影响37-43
• 第三章 甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒影响食管癌发病的机制研究43-58
• 第一节 不同食管细胞内OATP1B1和OATP1B3的表达情况43-48
• 第二节 甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒调控信号通路节点基因PP2A和Ras基因的表达48-49
• 第三节 甲基苄基亚硝胺和微囊藻毒素联合染毒信号通路分析49-58
• 结论58-59
• 参考文献59-63
• 综述 亚硝胺类消毒融产物和微囊藻毒素与食管癌发生关系的研究进展63-74
• 参考文献70-74
• 作者简介74-75
• 致谢75

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