白藜芦醇与镉诱导HEK 293T细胞自噬与凋亡关系的初步研究

发布时间：2017-10-16 20:44

  本文关键词：白藜芦醇与镉诱导HEK 293T细胞自噬与凋亡关系的初步研究

  更多相关文章： 镉 HEK 293T 白藜芦醇 自噬 溶酶体活性 自噬体-溶酶体融合 活性氧 细胞凋亡

【摘要】：本实验室的研究已经证明低浓度的镉(10 μM)可以诱导细胞自噬,而在高浓度镉刺激下细胞会发生凋亡。本实验采用细胞培养、透射电子显微镜、Western blot,倒置相差显微镜、激光共聚焦、流式细胞术等细胞生物学技术,以HEK 293T细胞为研究对象,研究分析了白藜芦醇与镉诱导的HEK 293T细胞自噬之间的关系；以镉诱导的自噬为前提,探究白藜芦醇与自噬体-溶酶体融合之间的关系；分析了白藜芦醇(RSV)的抗氧化性与镉诱导的自噬间的关系；探究白藜芦醇与镉诱导的细胞凋亡之间的关系。具体实验结果如下：1、白藜芦醇与镉诱导的HEK 293T细胞自噬的关系HEK 293T细胞悬液(5×105)接种于6孔培养板中,随机分成对照组和试验组。试验组：①细胞暴露于40μM中24 h；②细胞用白藜芦醇(40 μM)预处理1小时后暴露于(0-10μM)镉中24 h；③选用40 μM白藜芦醇和5 mM 3-MA联合8和10μ镉处理HEK 293T细胞24 h。本试验采用透射电子显微镜观察自噬体与自噬溶酶体；Western blotting分析自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达量的变化；激光共聚焦显微镜分析GFP-LC3的点状聚集。结果显示,HEK 293T细胞暴露在镉后,发现细胞内自噬体数目明显增多。白藜芦醇能加强镉诱导的自噬,且在8和10μM时变化明显,加入自噬抑制剂3-MA后这种现象被抑制。提示：镉能诱导自噬,而白藜芦醇能够协同镉引起细胞自噬。2、白藜芦醇与镉诱导细胞自噬中自噬体-溶酶体融合的关系HEK 293T细胞悬液(5×105)接种于6孔板中,选用40 μM RSV和/或5mM3-MA分别联合8和10μM Cd处理KEK 293T细胞24 h；选用40 μM RSV和/或3μM TG分别联合8和10 μMCd处理KEK 293T细胞24 h。利用Western blotting分析溶酶体标志蛋白cathepsin L、自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达量；用激光共聚焦观察GFP-LC3和LAMP2的共定位。结果显示,在镉诱导的细胞自噬中,白藜芦醇能增强溶酶体的活性,而当自噬被抑制时溶酶体的活性也降低；加入自噬体溶酶体融合抑制剂TG以后,虽然增加了细胞的自噬能力,却降低了溶酶体的活性,而白藜芦醇未能改变这种结果。提示：白藜芦醇可能起作用的阶段是在自噬体溶酶体融合之前3、白藜芦醇的抗氧化性与镉介导的细胞自噬之间的关系HEK 293T细胞悬液(5×105)接种于6孔板中。试验组：细胞用白藜芦醇(40州)预处理1小时后暴露于(0-10μM)镉中24 h；用40μM RSV和/或1μMEX-527分别联合10μM镉处理KEK 293T细胞24 h；用40μM RSV和/或1μM EX-527分别联合1 mM H2O2处理KEK 293T细胞24h。利用酶标仪检测活性氧ROS的表达量；Western blotting分析SIRT1蛋白、自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达量；用激光共聚焦GFP-LC3和LAMP2的共定位。结果显示,随着镉浓度的增加ROS也增加,而加入白藜芦醇后ROS降低；白藜芦醇能激活SIRT1,而当SIRT1的表达量被抑制时,白藜芦醇对自噬的促进作用也减弱。提示：白藜芦醇增强镉诱导的自噬可能都与其抗氧化性有关,而其中SIRT1起着重要的作用。4、白藜芦醇与镉诱导的细胞凋亡之间的关系HEK 293T细胞悬液(5×105)接种于6孔板中,适应性培养后,用40μMRSV、10μMCd、20μM Cd、10μM Cd+RSV和20 μM Cd+RSV分别处理HEK293T细胞。相应时间后用倒置相差显微镜观察细胞形态；Western blotting分析caspase-3的表达量；用流式细胞仪分析细胞凋亡数量。结果显示,HEK 293T细胞暴露于镉24 h后,细胞皱缩变形甚至死亡,而加入白藜芦醇后,细胞形态改变被抑制；镉诱导了caspase-3表达量增加,而加入白藜芦醇后被降低：镉诱导细胞凋亡可以被白藜芦醇阻滞。提示：白藜芦醇能抑制镉诱导的细胞凋亡。本研究在低浓度镉(0～10μM)诱导自噬的基础上进行。白藜芦醇能增强镉诱导的细胞自噬,而其作用阶段可能是在自噬体溶酶体融合之前,而且可能与白藜芦醇的抗氧化性有关,SIRT1可能在其中扮演着重要的角色,白藜芦醇还能抑制镉诱导的细胞凋亡。
【关键词】：镉 HEK 293T 白藜芦醇 自噬 溶酶体活性 自噬体-溶酶体融合 活性氧 细胞凋亡
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 第一部分 文献综述12-35
• 第一章 镉的性质及毒性作用13-20
• 1.1 镉的理化性质13
• 1.2 镉的毒性13-15
• 1.2.1 镉对人体的危害13-14
• 1.2.2 镉中毒的机理14
• 1.2.3 镉中毒的干预措施14-15
• 1.3 镉与氧化应激15-17
• 1.3.1 氧化应激15
• 1.3.2 镉致氧化应激15-17
• 参考文献17-20
• 第二章 自噬(Autophagy)机理的概述20-28
• 2.1 自噬的定义及其发生过程20-22
• 2.1.1 自噬的定义20-21
• 2.1.2 自噬的分类21
• 2.1.3 自噬的观察检测21-22
• 2.2 细胞自噬的分子机制22-23
• 2.3 细胞自噬与细胞凋亡的关系23
• 2.4 镉致细胞自噬与凋亡的研究进展23-25
• 参考文献25-28
• 第三章 白藜芦醇的性质及生物学功能28-35
• 3.1 白藜芦醇的来源及理化性质28
• 3.2 白藜芦醇的化学制备28-29
• 3.3 白藜芦醇的生物学功能29-30
• 3.3.1 白藜芦醇的抗氧化作用29
• 3.3.2 白藜芦醇的抗癌作用29-30
• 3.3.3 白藜芦醇对心血管疾病的保护作用30
• 3.4 白藜芦醇与自噬的关系30-31
• 3.5 白藜芦醇与SIRT1的关系31-32
• 参考文献32-35
• 第二部分 实验研究35-68
• 第四章 白藜芦醇与镉诱导的自噬关系的初步探究36-45
• 4.1 材料37
• 4.1.1 主要试剂37
• 4.1.2 实验仪器37
• 4.1.3 细胞系37
• 4.2 方法37-39
• 4.2.1 细胞的培养37-38
• 4.2.2 透射电子显微镜观察细胞自噬体、溶酶体形态38
• 4.2.3 免疫印记(Western blot)分析38-39
• 4.2.4 激光共聚焦分析39
• 4.2.5 数据处理39
• 4.3 结果与分析39-42
• 4.3.1 透射电子显微镜观察镉诱导HEK 293T细胞内自噬体的形成39-40
• 4.3.2 白藜芦醇能增强镉诱导的细胞自噬40-41
• 4.3.3 3-MA抑制镉诱导的细胞自噬及白藜芦醇的协同作用41-42
• 4.4 讨论42-44
• 参考文献44-45
• 第五章 白藜芦醇与镉诱导细胞自噬中自噬体-溶酶体融合的关系45-53
• 5.1 材料46
• 5.1.1 主要试剂46
• 5.1.2 实验仪器46
• 5.1.3 细胞系46
• 5.2 方法46-48
• 5.2.1 细胞的培养46-47
• 5.2.2 免疫印记(Western blot)分析47
• 5.2.3 激光共聚焦分析47-48
• 5.2.4 数据处理48
• 5.3 结果与分析48-50
• 5.3.1 白藜芦醇对溶酶体活性的影响48-49
• 5.3.2 白藜芦醇与自噬体溶酶体融合之间的关系49-50
• 5.3.3 激光共聚焦观察RSV/Cd对自噬体溶酶体融的影响50
• 5.4 讨论50-52
• 参考文献52-53
• 第六章 白藜芦醇的抗氧化性与镉介导的细胞自噬之间的关系53-61
• 6.1 材料54
• 6.1.1 主要试剂54
• 6.1.2 实验仪器54
• 6.1.3 细胞系54
• 6.2 方法54-56
• 6.2.1 细胞的培养54-55
• 6.2.2 活性氧检测55
• 6.2.3 免疫印记(Western blot)分析55
• 6.2.4 激光共聚焦分析55-56
• 6.2.5 数据处理56
• 6.3 结果与分析56-58
• 6.3.1 白藜芦醇能降低镉诱导的活性氧增加56-57
• 6.3.2 白藜芦醇通过激活SIRT1调节镉诱导的自噬57-58
• 6.3.3 抑制SIRT1可以减少自噬体溶酶体融合58
• 6.4 讨论58-60
• 参考文献60-61
• 第七章 白藜芦醇与镉诱导的细胞凋亡之间的关系61-68
• 7.1 材料61-62
• 7.1.1 主要试剂61-62
• 7.1.2 实验仪器62
• 7.1.3 细胞系62
• 7.2 方法62-64
• 7.2.1 细胞的培养62
• 7.2.2 细胞活性形态学分析62-63
• 7.2.3 免疫印记(Western blot)分析63
• 7.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡63
• 7.2.5 数据处理63-64
• 7.3 结果与分析64-66
• 7.3.1 相差倒置显微镜观察白藜芦醇对镉诱导的细胞凋亡的影响64-65
• 7.3.2 Western blot检测白藜芦醇对镉诱导的细胞凋亡的影响65-66
• 7.3.3 流式细胞术检测白藜芦醇对镉诱导的细胞凋亡的影响66
• 7.4 讨论66-67
• 参考文献67-68
• 全文总结68-69
• 英文缩略词表69-70
• 攻读硕士期间发表论文70-71
• 致谢71

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1 刘小}，

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