二氯甲烷肝脏毒性的实验研究

发布时间：2017-10-19 03:04

  本文关键词：二氯甲烷肝脏毒性的实验研究

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【摘要】：【研究目的】通过动物实验探讨二氯甲烷的肝脏毒性作用;探讨Nrf2/ARE信号通路介导的氧化应激在二氯甲烷肝毒性中的作用机制,为二氯甲烷接触人群的健康影响提供基础资料,也为研究二氯甲烷中毒的临床治疗方法提供新的理论基础。【研究方法】1、二氯甲烷肝脏毒性作用研究选用SPF级健康雄性昆明小鼠(20-25g)48只,适应环境1周后,随机分成对照组、低剂量组(1.3mg/L,1/50LC50)、中剂量组(6.4 mg/L,1/10LC50)和高剂量组(12.9 mg/L,1/5LC50)。对照组不染毒,正常喂养28d。染毒组采用呼吸道动式染毒方式染毒,每天染毒1次,每次持续2h,连续染毒28d。各组小鼠在同等条件下饲养,观察其一般生长状况,并在染毒第l、7、14、28d测小鼠体重。于染毒结束24h后处死小鼠,每组取6只小鼠的血清测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性。另6只则取肝脏测其湿重,取部分肝组织HE染色后观察组织病理学改变。取血清和肝组织匀浆测超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽(GSH)含量和总抗氧化能力(T-AOC)。酶联免疫吸附法测肝组织匀浆中活性氧(ROS)、细胞色素P450 2El(CYP2E1)含量。2、Nrf2/ARE信号通路在二氯甲烷致小鼠肝脏毒性中的作用机制研究选用SPF级健康昆明小鼠(20-25g)24只,适应环境1周后,随机分成空白对照组、溶剂对照组、二氯甲烷染毒组和叔丁基对苯二酚(tBHQ)干预组。空白对照组不染毒,正常喂养28d。其余三组采用呼吸道动式染毒方式高剂量(12.9 mg/L)染毒,每天1次,每次持续2h。染毒24h后,溶剂对照组每天经口灌胃0.2ml玉米油,tBHQ干预组每天经口灌胃0.2ml tBHQ质量浓度为1.25mg/ml的玉米油,每周灌胃6d,连续28d。各组小鼠在同等条件下饲养,观察小鼠的一般生长状况。于染毒结束后24h处死小鼠,取血清测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性。免疫组化法测Nrf2蛋白在肝组织的表达情况。酶联免疫吸附法测肝组织匀浆中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和血红素氧化酶1(HO-1)含量。【研究结果】1、二氯甲烷对小鼠肝脏的毒性作用染毒组小鼠每次染毒开始时活动异常,多动、不安,一段时间后小鼠活动减少,精神变得萎靡不振,聚团静伏。在各时间节点,与对照组比较,染毒组小鼠体重无明显变化,差异均无统计学意义(p0.05)。与对照组比较,各剂量组肝脏湿重和脏器系数均升高,差异有统计学意义(p0.05)。小鼠肝脏病理变化结果:对照组肝小叶清晰,肝索呈放射状排列,肝细胞和肝窦正常;染毒组肝小叶结构不清,肝索紊乱,肝窦充血,肝细胞弥漫水肿,出现空泡样改变。高剂量组可见点状坏死伴炎细胞侵润。小鼠肝功能指标变化结果:与对照组比较,高剂量染毒组中ast、alt和alp酶活性升高明显且差异均有统计学意义(p0.05);ast、alt和alp活性随着染毒剂量的增加呈逐渐上升趋势(r=0.829,r=0.932,r=0.589,p0.01)。2、氧化应激与二氯甲烷肝毒性的关系与对照组比较,肝组织匀浆中各染毒剂量组ros含量升高明显;中、高剂量组cyp2e1含量升高明显(p0.05),且随着染毒剂量的增加均呈逐渐上升趋势(r=0.935,r=0.869,p0.01),两者含量呈高度正相关(r=0.858,p0.01)。与对照组比较,血清和肝组织匀浆中sod活性升高,mda含量升高(p0.05),随着染毒剂量的升高呈逐渐升高趋势;血清中gsh含量降低(p0.05),随着染毒剂量的增加大体呈下降趋势(r=-0.806,p0.01),肝组织匀浆中高剂量组gsh含量升高明显(p0.05),随染毒剂量的增加呈上升趋势(r=0.772,p0.01);血清中、高剂量组t-aoc含量降低(p0.05),随着染毒剂量的增加血清t-aoc含量呈明显下降趋势(r=-0.692,p0.01),肝组织匀浆中t-aoc含量无明显变化(p0.05)。经相关性分析,血清中和肝组织匀浆中mda含量呈正相关(r=0.582,p0.05),sod活性呈正相关(r=0.608,p0.05),gsh含量呈负相关(r=-0.611,p0.05),t-aoc含量不存在相关性(r=0.02,p0.05)。小鼠肝组织匀浆中ros含量与血清中ast、alt、alp酶活性均呈正相关(r=0.808,r=0.832,r=0.549,p0.01)。3、nrf2/are信号通路在二氯甲烷致小鼠肝脏毒性中的作用机制对照组nrf2在少数肝细胞胞浆中表达,胞核内未见阳性表达;溶剂对照组和二氯甲烷染毒组棕色颗粒在胞浆中表达增加,也有少量在细胞核表达;tbhq干预组棕色颗粒在胞浆中的表达降低,主要集中于细胞核。与空白对照组比较,溶剂对照组和二氯甲烷染毒组ROS、MDA、GST和HO-1含量升高(P0.05),tBHQ干预组ROS、MDA含量变化不明显,tBHQ干预组GST、HO-1含量升高(P0.05);与溶剂对照组和二氯甲烷染毒组比较,tBHQ干预组ROS、MDA含量下降明显,GST、HO-1含量升高明显,差异均有统计学意义(P0.05)。与空白对照组比较,溶剂对照组和二氯甲烷染毒组AST、ALT和ALP活性升高(P0.05),tBHQ干预组各指标活性无明显变化(P0.05);与二氯甲烷染毒组比较,tBHQ干预组各指标活性下降明显(P0.05);与溶剂对照组比较,二氯甲烷染毒组AST、ALT活性升高,tBHQ干预组ALT活性降低(P0.05)。【研究结论】1、在本实验条件下二氯甲烷染毒后小鼠肝脏病理和肝功指标发生变化,提示肝细胞受损,出现炎症、坏死等。二氯甲烷可引起小鼠肝脏结构和功能的损伤。2、氧化应激在二氯甲烷诱导小鼠肝脏毒性中起重要作用。机体氧化应激和脂质过氧化反应的提高,抗氧化应激能力的降低是导致炎症反应,肝细胞损伤的重要原因。而氧化应激的产生可能与二氯甲烷进入肝脏后刺激CYP2E1合成增加有关。3、二氯甲烷进入小鼠体内导致氧化应激水平的升高,激活Nrf2/ARE信号通路的抗氧化能力,由于ROS升高的水平超出Nrf2/ARE信号通路的抗氧化能力,导致体内抗氧化系统耗竭,ROS清除不足在体内蓄积进而对肝细胞产生氧化损伤。tBHQ作为抗氧化剂和通路激活剂,可增强Nrf2/ARE信号通路的抗氧化能力,拮抗氧化应激反应,使氧化/抗氧化系统维持在平衡状态,降低二氯甲烷对肝脏的损伤。
【关键词】：二氯甲烷 肝毒性 氧化应激 Nrf2/ARE信号通路
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 主要符号表14-15
• 前言15-20
• 1 二氯甲烷的一般毒性15
• 2 二氯甲烷的肝脏毒性15-17
• 3 二氯甲烷的肝脏毒性与氧化/抗氧化关系17
• 4 Nrf2/ARE信号通路在二氯甲烷致小鼠肝脏毒性中的作用机制17-20
• 第一部分 研究内容与方法20-28
• 1.1 主要试剂与仪器20-21
• 1.1.1 主要试剂20
• 1.1.2 主要仪器20-21
• 1.2 实验动物及染毒方法21-22
• 1.3 实验方法22-27
• 1.3.1 染毒仪器调试及稳定性测试22
• 1.3.2 组织样品的采集及处理22
• 1.3.3 小鼠一般状况观察22
• 1.3.4 小鼠肝脏组织脏器系数的测定22-23
• 1.3.5 小鼠血清肝功能指标测定23
• 1.3.6 小鼠血清和肝组织匀浆中氧化应激指标的测定23-25
• 1.3.7 小鼠肝组织病理学观察及免疫组织化学测定25-26
• 1.3.8 小鼠肝组织匀浆CYP2E1、ROS、MDA、GST和HO-1 含量的测定26-27
• 1.4 统计学分析27-28
• 第二部分 结果28-40
• 2.1 染毒装置稳定性测试28
• 2.2 二氯甲烷对小鼠肝脏的毒性作用28-31
• 2.2.1 二氯甲烷对小鼠一般情况和体重的影响28-29
• 2.2.2 小鼠肝脏湿重及脏器系数的变化29
• 2.2.3 小鼠肝脏组织的病理变化29-30
• 2.2.4 小鼠血清中肝功指标的变化30-31
• 2.3 氧化应激与二氯甲烷肝毒性的关系31-36
• 2.3.1 二氯甲烷对小鼠氧化应激水平的影响31-33
• 2.3.2 二氯甲烷对小鼠脂质过氧化和抗氧化能力的影响33-35
• 2.3.3 小鼠肝组织匀浆和血清中指标相关性分析35
• 2.3.4 小鼠肝组织匀浆ROS含量与血清AST、ALT、ALP活性相关性分析35-36
• 2.4 Nrf2/ARE信号通路在二氯甲烷致小鼠肝脏毒性中的作用机制36-40
• 2.4.1 小鼠肝组织Nrf2表达情况36-37
• 2.4.2 小鼠肝组织匀浆ROS、MDA、GST和HO-1 表达水平37-38
• 2.4.3 小鼠血清中肝功指标的变化38-40
• 第三部分 讨论40-48
• 3.1 二氯甲烷的肝脏毒性作用40-42
• 3.2 二氯甲烷的肝脏毒性与氧化应激的关系42-44
• 3.3 Nrf2/ARE信号通路在二氯甲烷致小鼠肝脏毒性中的作用机制44-48
• 结论48-49
• 参考文献49-54
• 攻读学位期间取得的研究成果54-55
• 致谢55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1058673