胆红素致大鼠大脑皮质和海马神经元毒性损害的比较研究

发布时间：2017-10-19 19:08

  本文关键词：胆红素致大鼠大脑皮质和海马神经元毒性损害的比较研究

  更多相关文章： 胆红素 皮质神经元 海马神经元 神经毒性

【摘要】：目的：采用SD大鼠皮质神经元和海马神经元细胞原代培养技术,从时间效应关系和剂量效应关系两个维度比较胆红素对大脑不同区域神经元细胞之间的毒性损害程度上的差异,为进一步阐明胆红素的神经毒性机制提供科学依据。方法：出生24小时以内的SD大鼠乳鼠,仔细取出大脑组织,分离大脑皮层和海马,经胰酶消化获得大脑皮层神经元和海马神经元,采用无血清培养技术建立神经细胞体外培养系统。采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)间接免疫荧光方法对原代培养的神经元进行鉴定,然后将培养的细胞暴露于不同剂量的胆红素。实验分为一个对照组和三个胆红素染毒组,暴露剂量以培养基中胆红素终浓度表示,分别为25uM、50uM、100uM,对照组和染毒组分别于4h、12h、24h三个时间点观察毒性损害。观察指标和采用的方法包括：细胞毒性检测,采用MTT法；病理学观察,HE染色法；细胞凋亡,采用Hoechst 33342荧光染色法；Caspase-3活性,Caspase-3活性检测试剂盒；细胞内钙离子含量,荧光标记法,采用Fluo-3荧光探针。结果：(1)HE染色显示胆红素导致海马神经元和皮质神经元细胞形态的改变,胆红素染毒组与对照组比较,出现细胞间连接稀疏,突触收缩变短,细胞胞体缩小,细胞核边集、固缩、碎裂等改变,且皮质神经元HE染色结果中出现凋亡小体；(2) MTT实验显示胆红素导致海马神经元和皮质神经元细胞活性的降低,海马神经元与皮质神经元相比,细胞存活率更低；(3) Hoechst33342凋亡荧光染色并计数结果显示,胆红素染毒可引起神经元细胞核发生边集、固缩、碎裂等形态改变,胆红素可以导致海马神经元和皮质神经元细胞凋亡率的升高,随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长,凋亡率的变化显示出明显的剂量依赖和时间依赖性,染毒24h时,凋亡率最高,且海马神经元的凋亡率较皮质神经元更高；(4) Caspase-3活性检测结果显示,随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长,胆红素染毒可以导致海马神经元和皮质神经元细胞Caspase-3活性显著增强,染毒到24h时Caspase-3活性最强,且海马神经元Caspase-3活性变化率比皮质神经元更大；(5)胆红素可以导致皮质神经元和海马神经元细胞内钙离子浓度增加,随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长细胞内钙离子浓度迅速增加,染毒24h时细胞内钙离子浓度最高,且海马神经元细胞内钙离子浓度变化率高于皮质神经元。结论：高胆红素可导致体外培养皮质神经元和海马神经元毒性损害的发生,包括细胞形态改变,细胞活性降低,细胞凋亡率升高,细胞Caspase-3活性增强,破坏钙离子稳态导致细胞内钙离子浓度增加,其毒性大小与剂量和染毒时间存在一定的相关关系,且不同部位神经细胞对胆红素的毒性损害敏感性存在一定差异,海马神经元比皮质神经元更敏感,提示海马神经元是胆红素神经毒性更重要的靶细胞。
【关键词】：胆红素 皮质神经元 海马神经元 神经毒性
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-13
• 第一章 材料与方法13-22
• 1.1 材料13-14
• 1.1.1 主要试剂13
• 1.1.2 主要仪器13-14
• 1.2 方法14-22
• 1.2.1 溶液配制14-15
• 1.2.2 实验方法与步骤15-21
• 1.2.3 统计学处理21
• 1.2.4 质量控制21-22
• 第二章 结果22-41
• 2.1 海马神经元与皮质神经元原代培养及鉴定22-23
• 2.1.1 海马神经元原代培养与鉴定22
• 2.1.2 皮质神经元原代培养与鉴定22-23
• 2.2 胆红素导致神经元细胞形态改变23-25
• 2.2.1 胆红素导致海马神经元形态改变23-24
• 2.2.2 胆红素导致皮质神经元形态改变24-25
• 2.3 胆红素导致神经元细胞活性的变化25-28
• 2.3.1 胆红素引起海马神经元细胞活性的变化25-26
• 2.3.2 胆红素引起皮质神经元细胞活性的变化26-27
• 2.3.3 皮质神经元与海马神经元细胞活性比较27-28
• 2.4 胆红素导致神经元细胞凋亡率的改变28-33
• 2.4.1 胆红素导致海马神经元凋亡率的改变28-29
• 2.4.2 胆红素导致皮质神经元凋亡率的改变29-30
• 2.4.3 皮质神经元与海马神经元凋亡率比较30-33
• 2.5 胆红素导致神经元细胞Caspase-3活性变化的影响33-36
• 2.5.1 胆红素导致海马神经元Caspase-3活性变化的影响33-34
• 2.5.2 胆红素导致皮质神经元Caspase-3活性变化34-35
• 2.5.3 海马神经元与皮质神经元Caspase-3活性比较35-36
• 2.6 胆红素对神经元细胞内钙离子稳态的影响36-41
• 2.6.1 胆红素对海马神经元细胞内钙离子稳态的影响37
• 2.6.2 胆红素对皮质神经元细胞内钙离子稳态的影响37-38
• 2.6.3 皮质神经元与海马神经元细胞内钙离子比较38-41
• 第三章 讨论41-50
• 3.1 海马神经元与皮质神经元的原代培养与鉴定41-42
• 3.1.1 海马神经元与皮质神经元的原代培养41-42
• 3.1.2 神经元细胞的鉴定及体外高胆红素血症模型的建立42
• 3.2 胆红素导致神经元形态改变42-43
• 3.3 胆红素对皮质神经元和海马神经元细胞活性的影响43-45
• 3.4 胆红素对皮质神经元和海马神经元凋亡率的影响45-46
• 3.5 胆红素导致神经元Caspase-3活性变化46-47
• 3.6 胆红素导致神经元内钙离子稳态的改变47-50
• 第四章 结论50-51
• 4.1 主要结论50
• 4.2 研究展望50-51
• 参考文献51-55
• 在学期间研究成果55-56
• 致谢56

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本文编号：1062807