四氯苯醌诱导PC12细胞神经毒性的炎性有关信号通路分析

发布时间：2017-10-29 11:09

  本文关键词：四氯苯醌诱导PC12细胞神经毒性的炎性有关信号通路分析

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【摘要】：五氯酚(PCP)和六氯苯(HCB)是典型的持久性有机污染物,具有致畸、致癌、致突变性质,严重地威胁着人类身体健康。尽管二者在环境中化学性质很稳定,但仍然可以降解生成其他代谢产物。六氯苯可以通过细胞色素P450途径代谢生成具有活性的四氯苯醌(TCBQ)和四氯氢醌(TCHQ),五氯酚则可以通过鞘氨醇杆菌代谢为四氯苯醌,然后进一步还原成四氯氢醌。在这些代谢过程中会产生大量ROS,破坏生物体内的氧化还原平衡,导致毒性效应的发生,如遗传毒性、肝毒性、免疫毒性、神经毒性等。随着人口老龄化现象地加重,许多神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森等疾病的患病率也逐渐增高。引起这些疾病的因素很多,包括环境、基因及老龄化等相关内源性因素,但基本可以概括为由于氧化应激的产生导致的神经炎症形成。近几年来,关于六氯苯和五氯酚的神经毒性研究已经很多,但是关于四氯苯醌的神经毒性,特别是炎症病理机制的研究资料却很少见。探讨四氯苯醌诱导PC12细胞炎症反应的机制,可以为有关神经系统疾病的预防和治疗提供新思路。因此,本文选用PC12细胞作为研究对象,设想它引起的炎症毒性与ROS的产生有关,做了以下两部分实验。(一)四氯苯醌激活IKK/IκB/NF-κB信号通路的机制研究本实验旨在比较六氯苯、五氯酚、四氯氢醌和四氯苯醌四种化合物对PC12细胞的细胞毒性、ROS产量、促炎症因子表达的作用,然后进一步探讨四氯苯醌激活NF-κB信号通路的机制。首先利用CCK-8实验,比较了四种化合物在不同浓度、不同时间条件下的细胞毒性,结果发现四种化合物的细胞毒性呈现时间和浓度依赖性增加,并且与ROS的形成密切相关,其中TCBQ和TCHQ毒性强于pcp、hcb。从dcfh-da探针检测ros水平及免疫印迹检测促炎症因子表达的实验结果中发现tcbq和tchq对ros和促炎症因子的诱导作用强于hcb和pcp。接着用免疫印迹和rt-qpcr实验手段从浓度梯度上考察了四氯苯醌诱导ikk/iκb/nf-κb信号通路相关炎症蛋白的表达情况及促炎症因子的mrna水平,及采用nf-κb特异性抑制剂pdtc考察了tcbq诱导nf-κb核转录活性。实验结果显示tcbq可以诱导nf-κb信号通路中相关蛋白表达,还可以提高促炎症因子的mrna水平,pdtc则明显抑制tcbq诱导的nf-κb核转录及其与目的基因结合的活性。抗氧化剂nac、维生素e和姜黄素可以清除tcbq作用细胞产生的ros,还可以部分抑制ikk/iκb/nf-κb信号通路中相关蛋白表达,这说明ros在ikk/iκb/nf-κb信号通路的活化中扮演着重要角色。(二)褪黑素拮抗四氯苯醌激活hmgb1/tlr4/myd88信号通路的机制研究四氯苯醌的促炎、促氧化作用在第一部分实验中已经得到证实;关于hmgb1/tlr4/myd88在炎症研究中的重要性,很多文献都有介绍;褪黑素是松果体分泌的一种激素,为强大的内源性抗氧化剂,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用。基于以上三点,本实验把tcbq、褪黑素、hmgb1/tlr4/myd88三者联系起来,对它们的相互作用机制进行了探讨。首先利用cck-8实验筛选了褪黑素减缓tcbq细胞毒性的最适给药浓度,最终我们选用200μm褪黑素预处理细胞1h,再给予25μmtcbq培养细胞6h进行后面的实验研究。用免疫印迹实验、免疫共沉淀及rt-qpcr实验考察了tcbq对tlr4、md2、cd14、myd88的影响,还考察了褪黑素在这个过程中的作用,结果发现tcbq可以诱导tlr4、md2、cd14、myd88的蛋白表达,tlr4和myd88的mrna水平上升,及促进tlr4与其适配器md2、cd14、myd88的结合,然而褪黑素抑制了tlr4和其适配器的表达,还抑制了它们的相互结合作用。接着也考察了褪黑素对tcbq诱导的mapks活性的影响,及对下游炎症因子的表达情况,结果显示褪黑素可以逆转tcbq对mapks活性的诱导作用。用tlr4sirna、myd88sirna转染pc12细胞观察蛋白表达情况,用tlr4敲除的小鼠实验观察小鼠脑部切片的he染色、免疫组化和免疫荧光图,发现tcbq在tlr4和myd88基因缺陷的情况下,炎症损伤明显降低,这强调了tlr4信号途径在tcbq诱导的神经炎症中的重要作用。接着我们探讨了tcbq是如何激活tlr4信号通路的。通过免疫荧光、免疫印迹及免疫共沉淀实验,证明tcbq可以使hmgb1在细胞核内发生乙酰化和磷酸化修饰,随后进入细胞质,释放到培养基里。用免疫印迹、免疫荧光、rt-qpcr和免疫共沉淀实验考察了tcbq在hmgb1和其受体中的作用,结果发现tcbq可以诱导HMGB1及其受体(TLR2、TLR4、TLR9、RAGE)的表达,及促进HMGB1与其受体的结合,在这些受体中,HMGB1与TLR4的作用最强。接着通过蔗糖密度梯度分离实验,将裂解液分成12个片段,再利用免疫印迹实验证实TCBQ、HMGB1和LPS可以诱导TLR4/MD2向脂筏区域募集,褪黑素作为抗氧化剂跟NAC、脂筏抑制剂(β-环糊精和制霉菌素)显示相同的结果,这说明了ROS参与了TCBQ诱导TLR4向脂筏转运的过程。用HMGB1 si RNA转染PC12细胞,观察相关蛋白表达情况,发现褪黑素可以抑制HMGB1调控TCBQ诱导的TLR4信号途径。用TLR4基因敲除的小鼠,观察到TLR4基因缺陷可以保护TCBQ引起的小鼠脑损伤,同时还可以部分抑制HMGB1出核及释放。综合以上两部分实验,可得知四氯苯醌诱导神经炎症反应,主要是通过活性氧激活IKK/IκB/NF-κB信号通路和促进细胞内HMGB1释放,随后招募TLR4向脂筏区域转录。
【关键词】：四氯苯醌 ROS 神经炎症 IKK/IκB/NF-κB HMGB1/TLR4/MyD88
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 缩写符号对照表14-15
• 第一章 绪论15-23
• 1.1 持久性有机污染物15-16
• 1.1.1 持久性有机污染物的特性15
• 1.1.2 持久性有机污染物的种类15
• 1.1.3 持久性有机污染物的危害15-16
• 1.1.4 持久性有机污染物的国内外现状分析16
• 1.2 六氯苯16-17
• 1.3 五氯酚17
• 1.4 四氯苯醌17-18
• 1.5 褪黑素18-19
• 1.6 NF-κB信号通路19
• 1.7 HMGB1/TLR4/MyD88信号通路19-21
• 1.7.1 HMGB1的结构特征19-20
• 1.7.2 HMGB1的分泌和释放20
• 1.7.3 HMGB1的受体及信号转导20-21
• 1.8 课题意义和依据21-23
• 第二章 四氯苯醌激活IKK/IκB/NF-κB信号通路的机制研究23-41
• 2.1 引言23
• 2.2 实验材料23-26
• 2.2.1 实验试剂23-24
• 2.2.2 实验仪器24-25
• 2.2.3 常用试剂制备方法25-26
• 2.3 实验方法26-33
• 2.3.1 细胞前处理26
• 2.3.2 细胞存活率实验26
• 2.3.3 细胞蛋白的提取26-27
• 2.3.4 细胞内ROS水平检测27
• 2.3.5 Western Blot实验27-28
• 2.3.6 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)28-29
• 2.3.7 PGE2酶联免疫吸附(ELISA)实验29-30
• 2.3.8 细胞内NO含量检测30
• 2.3.9 免疫荧光实验30-31
• 2.3.10 电泳迁移率变动分析(EMSA)实验31-32
• 2.3.11 双荧光素酶报告基因实验32-33
• 2.3.12 数据分析33
• 2.4 实验结果33-38
• 2.4.1 四种化合物的细胞毒性、ROS水平和促炎症因子蛋白表达情况33-34
• 2.4.2 TCBQ对PC12细胞NF-κB信号通路活化的影响34-35
• 2.4.3 TCBQ对PC12细胞促炎症因子蛋白和mRNA水平的影响35-36
• 2.4.4 PDTC对TCBQ诱导NF-κB信号通路活化的影响36-37
• 2.4.5 抗氧化剂对TCBQ诱导NF-κB信号通路活化的影响37-38
• 2.5 讨论38-41
• 第三章 褪黑素拮抗TCBQ激活HMGB1/TLR4/MyD88信号通路的机制研究41-65
• 3.1 引言41
• 3.2 实验材料41-42
• 3.2.1 实验试剂41-42
• 3.2.2 实验对象42
• 3.2.3 实验仪器42
• 3.3 实验方法42-49
• 3.3.1 细胞前处理42
• 3.3.2 动物模型建立42-43
• 3.3.3 组织病理学检查43
• 3.3.4 免疫组化实验43-44
• 3.3.5 组织免疫荧光44
• 3.3.6 蛋白提取44-45
• 3.3.7 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)45-46
• 3.3.8 Western Blot实验46
• 3.3.9 电泳迁移率变动分析(EMSA)实验46
• 3.3.10 免疫共沉淀(Co-IP)46-47
• 3.3.11 细胞免疫荧光实验47-48
• 3.3.12 siRNA瞬时转染PC12细胞48
• 3.3.13 蔗糖密度梯度离心法分离脂筏48-49
• 3.3.14 数据分析49
• 3.4 实验结果49-60
• 3.4.1 褪黑素抑制TCBQ诱导PC12细胞存活率下降49-50
• 3.4.2 褪黑素制TCBQ诱导TLR4和其适配器蛋白的表达及结合50-51
• 3.4.3 褪黑素抑制TCBQ诱导MAPKs活性51-52
• 3.4.4 褪黑素抑制TCBQ诱导促炎症因子蛋白和mRNA表达52-53
• 3.4.5 TLR4、MyD88 si RNA保护PC12细胞免受TCBQ诱导的炎症损伤53
• 3.4.6 TLR4基因缺陷保护小鼠免受TCBQ诱导的脑损伤53-54
• 3.4.7 褪黑素阻断TCBQ诱导HMGB1核质转录和释放54-55
• 3.4.8 TCBQ诱导HMGB1相关受体的表达及HMGB1与其受体的结合55-56
• 3.4.9 褪黑素抑制TCBQ诱导TLR4向脂筏区域募集56-57
• 3.4.10 HMGB1 siRNA抑制TCBQ诱导的炎症因子蛋白表达57-58
• 3.4.11 TCBQ诱导小鼠炎症因子表达及HMGB1的释放部分依赖TLR458-60
• 3.5 讨论60-65
• 全文总结65-67
• 参考文献67-77
• 致谢77-79
• 发表论文79

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本文编号：1112703