拟穴青蟹过敏原精氨酸激酶的抗原表位分析研究

发布时间：2017-11-03 02:00

  本文关键词：拟穴青蟹过敏原精氨酸激酶的抗原表位分析研究

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【摘要】：食物过敏作为食品安全的热点问题在全球引起了广泛关注,甲壳类动物是联合国粮农组织(FAO)公布的八大类过敏食物之一。蟹类等甲壳类水产品味道鲜美、营养丰富,是重要的水产资源;但随着蟹类消费量的增加,因食用蟹类而导致过敏的报道也随之增多。精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是存在于甲壳类和软体类动物的泛过敏原,对其抗原表位的全面了解能够为开发低致敏食品和甲壳类过敏疾病的诊断治疗提供依据。本文首先从拟穴青蟹(Scylla paramamosain)肌肉中纯化得到AK,通过体外模拟胃液降解AK,降解产物的免疫活性检测结果表明其降解产物仍具有较强的免疫原性;通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)对AK的胃液消化产物进行分离纯化,得到具有Ig G/Ig E结合活性的5个肽段。分别采用天然AK和分段表达产物r AK1(AA:87-186)、r AK2(AA:172-265)作为抗原建立小鼠过敏模型,以确定AK抗原表位的优势区域,结果显示天然AK组和r AK1组的小鼠血清特异性Ig E、Th2型细胞因子IL-4和IL-13均显著升高,表明天然AK和r AK1能够诱导小鼠过敏反应,提示r AK1为AK的抗原表位优势区。采用纯化AK免疫新西兰大白兔获得兔抗拟穴青蟹AK特异性抗血清,通过Protein A柱层析得到纯化的兔抗拟穴青蟹AK Ig G,以纯化的Ig G为靶蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行生物淘选,获得与抗原特异性结合的5个肽段。利用Loca Pep软件分析淘选出的肽段,模拟得到4个构象表位C-AK-1(D3A4K43M1A5T49T44I7)、C-AK-2(L31K33V35T32E11E18F14S34D37)、C-AK-3(V177G172M173D176Q178T174L181K175L187)和C-AK-4(R202L170Y203E190P205W204L187T206Y145),以及关键氨基酸依次为D3,K33,T174和W204。根据噬菌体展示淘选结果设计合成了19个重叠肽段,利用甲壳类过敏患者血清检测发现与血清Ig G特异识别结合的7个肽段(AA:113-127,127-141,134-148,141-155,204-218,211-225和316-330)和与血清Ig E特异识别结合的6个肽段(AA:113-127,127-141,141-155,204-218,211-225和316-330)。进一步通过肥大细胞(RBL-2H3)脱颗粒实验确定AK的4个线性表位:L-AK-1(AA:113-127),L-AK-2(AA:127-141),L-AK-3(AA:141-155)和L-AK-1(AA:204-218)。利用十二烷基磺酸钠(SDS)、β-巯基乙醇(β-Me)、二硫苏糖醇(DTT)、尿素和盐酸胍等变性剂处理天然AK,通过免疫印迹检测变性处理后AK的Ig E结合活性变化,结果表明AK的致敏性依赖于其空间构象的完整性,存在于分子内部的二硫键Cys201-Cys271对于维持AK的空间构象具有关键作用,是影响AK致敏性的关键位点。综上,本研究对拟穴青蟹AK的抗原表位进行了定位分析,确定了AK致敏性的关键位点及其构效关系,这些结果为开发低致敏食品和预防治疗过敏性疾病提供理论指导。
【关键词】：拟穴青蟹 精氨酸激酶 抗原表位 小鼠模型 细胞模型 噬菌体展示 变性处理
【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R155.5
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 主要符号表11-12
• 第1章 引言12-19
• 1.1 过敏性疾病与食物过敏12-13
• 1.2 食物过敏原13-14
• 1.2.1 常见食物过敏原13
• 1.2.2 水产品过敏原13-14
• 1.3 过敏原的抗原表位类型14-15
• 1.3.1 构象表位14-15
• 1.3.2 线性表位15
• 1.4 过敏原的抗原表位研究方法及进展15-18
• 1.4.1 抗原表位的分析方法15-17
• 1.4.2 噬菌体展示随机肽库在抗原表位分析中的应用17
• 1.4.3 水产品过敏原的抗原表位研究进展17-18
• 1.5 本研究的目的与意义18-19
• 第2章 材料与方法19-33
• 2.1 材料19-24
• 2.1.1 动物19
• 2.1.2 血清19
• 2.1.3 主要仪器设备19-20
• 2.1.4 主要试剂20-21
• 2.1.5 实验所用溶液及配制方法21-24
• 2.2 实验方法24-33
• 2.2.1 拟穴青蟹精氨酸激酶的纯化和鉴定24-26
• 2.2.2 AK的酶解与酶解产物免疫活性分析26-27
• 2.2.3 Balb/c小鼠过敏模型建立27-29
• 2.2.4 噬菌体展示肽库的生物淘选及生物信息学分析29-31
• 2.2.5 重叠肽的设计合成及免疫活性分析31-32
• 2.2.6 活性肽段的细胞脱颗粒实验32
• 2.2.7 AK的变性处理32
• 2.2.8 统计分析32-33
• 第3章 结果与分析33-53
• 3.1 拟穴青蟹AK的纯化和鉴定33-34
• 3.2 拟穴青蟹AK的酶解及酶解产物的免疫活性分析34-36
• 3.2.1 AK的酶法降解34
• 3.2.2 AK酶解产物的分离纯化及免疫活性分析34-36
• 3.3 拟穴青蟹AK主要抗原表位区域的确定36-40
• 3.3.1 AK分段表达产物的纯化和鉴定36-37
• 3.3.2 AK分段表达产物的小鼠模型的建立37-40
• 3.4 拟穴青蟹AK构象表位的确定40-46
• 3.4.1 噬菌体展示肽库的生物淘选40-44
• 3.4.2 LocaPep模拟AK构象表位44-46
• 3.5 拟穴青蟹AK线性表位的确定46-51
• 3.5.1 合成肽的免疫活性分析46-49
• 3.5.2 活性肽段刺激RBL-2H3 细胞脱颗粒实验49-51
• 3.6 影响AK致敏性的关键位点确定51-53
• 第4章 讨论53-58
• 4.1 AK的降解产物分析53-54
• 4.2 AK主要抗原表位区域的确定54
• 4.3 AK构象表位的分析54-55
• 4.4 AK线性表位的分析55-56
• 4.5 AK致敏性的关键位点分析56-58
• 第5章 结论与展望58-59
• 致谢59-60
• 参考文献60-67
• 在学期间发表的学术论文67

【二级参考文献】

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1 周晓秋;于广成;王U，

本文编号：1134113