反式转录因子Nrf2在百草枯致小鼠脑组织LncRNA表达改变中的作用

发布时间：2017-11-05 18:00

  本文关键词：反式转录因子Nrf2在百草枯致小鼠脑组织LncRNA表达改变中的作用

  更多相关文章： 百草枯 MPTP 多巴胺能神经元 LncRNA 表观遗传毒理学 神经毒性 Nrf2 氧化应激

【摘要】：目的探讨百草枯(PQ)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)致小鼠中脑炓质损害时长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)和mRNA表达谱的变化情况,并比较这两种神经毒物所致LncRNA和mRNA表达谱改变模式;应用Nrf2基因敲除小鼠探讨反式转录因子Nrf2在百草枯、MPTP致小鼠中脑黑质LncRNA和mRNA表达谱改变中的可能作用。方法(1)应用已建立的PQ致PD模型的方法,即生理盐水、10 mg/kg体重PQ、30 mg/kg体重MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)ICR小鼠,取黑质组织进行LncRNA、mRNA芯片检测(每组三片),分析LncRNA和mRNA表达谱变化,并通过Volcano Plot过滤,确定差异表达LncRNA和mRNA(差异倍数(FC)≥1.5且p0.05),对差异表达mRNA进行基因本体(GO)分析和KEGG通路分析。(2)生理盐水、5 mg/kg体重PQ、10 mg/kg体重PQ、30 mg/kg体重MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)ICR小鼠(n=4),染毒结束后取黑质、海马、大脑皮层组织。LncRNA表达谱挑选出6个表达差异倍数最大的LncRNAs(NR-030777、NR-027648、AK078503、AK047865、NR-024257和uc007nsi.1),用荧光定量RT-PCR验证其在小鼠黑质组织的表达及探讨其在海马、大脑皮层组织表达情况,并用荧光原位杂交(FISH)探索NR-030777、NR-027648在小鼠脑组织(海马,黑质,大脑皮层)水平、细胞(多巴胺能神经元和星型胶质细胞)和亚细胞水平的分布情况及表达(n=3)。(3)用Coding-non-coding(CNC)相关分析预测上述6个LncRNA靶基因,预测到的潜在靶基因结果与mRNA芯片检测结果比对分析,结合靶基因GO分析和pathway分析确认潜在的可能下游靶基因。(4)应用qRT-PCR实验方法验证NR_030777和NR_027648的部分靶基因mRNA表达情况。(5)免疫荧光实验方法定位检测nr-030777与其同源蛋白编码基因zfp326、nr-027648与其同源蛋白编码基因zc3h14的共表达规律。结果(1)pq染毒小鼠后出现类pd样行为异常,nrf2(-/-)小鼠表现更显著;pq染毒可引起nrf2(+/+)和nrf2(-/-)小鼠黑质lncrna和mrna表达谱改变。mptp染毒亦可引起nrf2(+/+)和nrf2(-/-)小鼠黑质lncrna和mrna表达谱改变。(2)在nrf2(+/+)生理盐水组黑质、海马、大脑皮层中,nr_024257在黑质表达量最高;nr_030777、ak047865、uc007nsi.1在大脑皮层表达量最低;ak078503、nr_027248在此三种脑部位组织表达没有差别。(3)应用nrf2(-/-)和nrf2(+/+)icr小鼠,荧光定量rt-pcr验证6个lncrna的结果与芯片表达谱结果大体一致。(4)应用原位杂交,可见lncrna_nr_027648和nr_30777在小鼠脑组织内广泛、大量的表达,包括海马,皮层,及中脑黑质等,且在海马组织的四个分区表达量没有明显差异。免疫荧光双标观察到lncrna-nr_027648和nr_30777在多巴胺能神经元中大量表达,而在星型胶质细胞中未见表达。在高倍镜下lncrna-nr_027648和nr_30777均定位表达于多巴胺能神经元胞质中,而细胞核未可见。不同处理组小鼠黑质组织,与nrf2(+/+)对照组相比,lncrna-nr_027648低剂量(5mg/kg)组表达略微上调,高剂量组pq(10mg/kg)表达上调,mptp组(30mg/kg)最大上调。与nrf2(-/-)对照组相比,10mg/kgpq或30mg/kgmptp处理nrf2(-/-)icr小鼠后,nr_027648表达上调。与nrf2(+/+)对照组相比,不同处理组nrf2(+/+)icr小鼠黑质组织,lncrna-nr_nr_030777低剂量(5mg/kg)组和mptp组表达上调,高剂量组pq(10mg/kg)表达最大。与nrf2(-/-)对照组相比,5mg/kgpq处理nrf2(-/-)icr小鼠后,nr_030777表达强度下调;10mg/kgpq或30mg/kgmptp处理nrf2(-/-)icr小鼠后,nr_030777表达下调。阴性探针未检测到杂交信号。(5)cnc相关分析预测uc007nsi.1,ak078503,ak047865,nr_024257,nr_030777和nr_027648共预测到1172个潜在靶基因(pcc≥0.80)。go分析结果、pathway分析结果提示:这6个lncrna潜在靶基因主要富集在ppar信号通路,p450参与外源物质代谢及脂质代谢等生物过程。其中cybb,zc3h14,duox1及duoxa2可能是nr_027648的下游靶基因,zfp326和cpne5可能是nr_030777的下游靶基因。总之,这些结果提示LncRNA可能参与PQ诱导神经细胞退行性病变过程。(6)Nrf2敲除引起小鼠中脑黑质组织中多巴胺能神经元内NR_030777表达下调与其同源蛋白编码基因Zfp326可能表达量的改变及NR_027648表达下调与其同源蛋白编码基因ZC3H14蛋白可能表达量的改变。结论(1)首次发现小鼠体内PQ暴露可改变LncRNA表达谱和mRNA表达谱,这可能是参与PQ诱导神经毒性的机制之一。(2)首次发现小鼠体内MPTP暴露可改变LncRNA表达谱和mRNA表达谱,这可能是参与MPTP诱导神经毒性的机制之一,LncRNA表达谱和mRNA表达谱改变不同于PQ引起的,但有相关。(3)转录因子Nrf2与LncRNAs可能存在潜在的基础生理调控关系,Nrf2在PQ或MPTP引起的LncRNA表达谱变化发挥作用。即:MPTP可能是通过其与反式作用因子Nrf2之间相互作用引起在中脑炓质LncRNA表达谱改变,其中NR_027648/cybb mRNA的途径改变是其中结果之一,这很可能是MPTP诱导神经毒性的机制之一;NR_030777/cpne5 mRNA/zfp326的途径改变是MPTP或PQ通过其与反式作用因子Nrf2之间相互作用引起在中脑炓质LncRNA表达谱改变结果之一;且PQ与反式作用因子Nrf2之间相互作用引起中脑炓质LncRNA表达谱改变,这种改变依PQ剂量不同而所不同,高剂量PQ的神经毒性中NR_030777,uc007nsi.1,AK078503,NR_027648可能起作用。(4)所发现的差异性表达的LncRNA及其相关下游靶基因的功能性失调在百草枯和MPTP致神经细胞损害中的作用将进行进一步的基因功能实验研究。特别是Nrf2参与的NR_027648的下游靶基因Cybb,Zc3h14,Duox1及Duoxa2,NR_030777的下游靶基因zfp326和cpne5的调节,我们正在进行进一步的基因功能实验研究。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 靳雁斌;丁学锋;司慧远;吴彦瑞;王晓文;吴燕;范文红;;小鼠Cpne5基因mRNA水平的表达分布及其在胚胎的表达定位[J];标记免疫分析与临床;2013年02期

2 王晓文;靳雁斌;景孝堂;吴燕;马鑫;刘淑红;范文红;范明;;外源表达的人copine Ⅴ诱导细胞死亡的研究[J];生物技术通讯;2006年02期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 吴彦瑞;CPNE5对细胞凋亡的作用与机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年

，

本文编号：1145236