SynapsinI在丙烯酰胺致突触可塑性损伤中的作用及BDNF干预的实验研究

发布时间：2017-11-08 21:45

  本文关键词：SynapsinI在丙烯酰胺致突触可塑性损伤中的作用及BDNF干预的实验研究

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【摘要】：目的通过探讨丙烯酰胺(acrylamide,ACR)对突触素?(Synapsin?)蛋白表达的影响、对N-甲基马来酰亚胺敏感因子(NSF)附着蛋白受体(SNARE)复合体结合/解离的影响和对Synapsin?上游磷酸化激酶的影响,明确ACR致神经元突触损伤对Synapsin?上下游蛋白调控的作用机制;通过对突触损伤的神经元进行脑源性神经营养因子(BDNF)的干预,进一步阐明BDNF对神经元突触损伤的保护作用。方法1将NB-1细胞通过二丁酰环腺苷酸(db-c AMP)诱导为成熟神经元细胞后,MTT检测ACR不同染毒浓度(0、25、50、100、150、200和250μg/ml)在不同染毒时间(24、48和72h)对NB-1细胞相对存活率的影响;免疫印记(western blot)技术检测Synapsin I磷酸化和非磷酸化蛋白表达,免疫共沉淀(Co-IP)试验检测神经元突触损伤前后SNARE复合体的结合/解离的变化,并使用Spearman对其进行相关性分析;使用光镜和电镜分别检测神经元突触损伤前后细胞形态、结构变化;通过western blot技术分别检测ACR染毒前后丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、环磷酸腺苷(PKA)和Ⅱ型钙离子/钙调素依赖蛋白激酶(Ⅱ型Ca2+/Ca M激酶)蛋白表达变化。2将诱导为成熟神经元的NB-1细胞经60μg/ml ACR染毒后给予不同浓度BDNF(50、75、100和125ng/ml)干预后通过MTT检测细胞相对存活率;使用荧光定量PCR技术检测BDNF给予干预前后Synapsin I m RNA表达的变化,Co-IP试验检测BDNF给予干预前后SNARE复合体结合/解离的变化。结果1 0、25、50和100μg/ml的ACR染毒剂量染毒NB-1细胞48h后,随着ACR染毒剂量的增加Synapsin I磷酸化和非磷酸化蛋白表达降低(P0.05);随着ACR染毒剂量的增加,SNARE复合体中突触融合蛋白(syntaxin)和突触小体相关蛋白(SNAP-25)逐渐解离;ACR染毒损伤NB-1细胞后,SNARE复合体中syntaxin和SNAP-25结合状态与Synapsin I、磷酸化Synapsin I(P-Synapsin I)蛋白表达呈正相关(Spearman相关系数r分别为0.897和0.935),与P-Synapsin I/Synapsin I差异性表达呈负相关(Spearman相关系数r为-0.250);从电镜图可知,25μg/ml ACR染毒浓度下观察到清亮球形突触小泡和含有高电子密度的致密颗粒的突触小泡;50μg/ml ACR染毒浓度下观察到含有高电子密度的致密颗粒的突触小泡;ACR对NB-1细胞染毒48h后,在100μg/ml ACR染毒浓度下MAPK蛋白表达降低(P0.05),在25μg/ml ACR染毒浓度下PKA蛋白表达降低(P0.05),随着ACR染毒剂量的增加,Ⅱ型Ca2+/Ca M依赖蛋白激酶表达增加(P0.05)。2荧光定量PCR试验结果表明75ng/ml BDNF+60μg/ml ACR试验组与60μg/ml ACR试验组相比,Synapsin I m RNA表达升高(P0.05);Co-IP试验结果表明BDNF干预前后SNARE复合体中两个单体syntaxin和SNAP-25结合/解离状态未发生变化。结论1突触内特异性神经递质的传递和释放可能与P-Synapsin I/Synapsin I差异性表达所调控的SNARE复合体的解离状态导致的突触功能损伤相关;ACR导致NB-1细胞神经元突触损伤后,Synapsin I上游磷酸激酶MAPK、PKA和Ⅱ型Ca2+/Ca M依赖蛋白激酶的表达受到影响。2 BDNF对神经元突触损伤具有一定的干预作用,但在本实验系统条件下结果表明BDNF的干预作用未能调控SNARE复合体解离状态。
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114

【参考文献】

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本文编号：1158942