硒对雄鼠睾丸硒蛋白组表达及相关生殖功能的影响

发布时间：2017-11-12 05:19

  本文关键词：硒对雄鼠睾丸硒蛋白组表达及相关生殖功能的影响

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【摘要】：研究背景及目的 男性不育是全球性的社会与健康问题，其病因复杂，但已明确硒（Selenium，Se）缺乏和过量导致的精子发生过程障碍是其病因之一。硒是机体必需的微量元素，在体内主要通过硒蛋白（Selenoproteins）的形式发挥生物学作用。目前关于机体硒缺乏或过量导致生殖系统结构损伤和功能下降已有不少报道，但是其具体机制尚未阐明，特别是研究机体硒水平对雄性生殖系统硒蛋白组表达的调控，筛选特异性功能硒蛋白，进而探究硒对雄性生殖健康的影响尚未见报道。 研究表明，精液硒水平在男性不育症患者中普遍偏低，而精液中硒水平在适宜浓度范围内越高，则精子数量越多，活力越强。人类精子细胞中含有大量的不饱和脂肪酸，易受精液中存在的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）攻击，诱发脂质过氧化，产生丙二醛（Malonaldehyd，MDA）等物质，从而损伤精子膜，导致精子活力下降，甚至功能丧失，造成不育。以谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidases，Gpxs）为代表的硒蛋白具有抗氧化作用，可清除机体内过多的自由基，推测其可通过抑制脂质过氧化作用，对保护精子免受氧化损伤，提高精子活力发挥重要作用。 迄今发现的人类硒蛋白有25种，鼠类硒蛋白有24种，大部分功能已知的有：含硒谷胱甘肽过氧化物酶族（Gpxs，5种）、脱碘酶族（Iodothyronine deiodinases，Dios，3种）、硫氧还蛋白还原酶族（Thioredoxin reductases，Txrnds，3种）、磷酸硒合成酶2（Sps2）、硒蛋白P（Sepp1）；功能仅有少量报道且未被完全证实的有：硒蛋白15-kDa（Sep15）、硒蛋白H（Selh）、I（Seli）、M（Selm）、N（Sepn1）、R（Selr）、S（Sels）、T（Selt）、W（Sepw1）；而硒蛋白K（Selk）、O（Selo）、V（Selv）等的功能则未知。目前普遍认为，具有氧化还原酶活性的硒蛋白是微量元素Se多种生物学功能的重要执行者，它们主要通过自身酶活性，在增强免疫力、抗衰老、预防心血管疾病和癌症、维持男性生殖功能等生命活动中发挥着重要甚至关键性的作用。 睾丸释放雄性激素（主要是睾酮）并形成生殖细胞，在组织学上包括生精小管（曲精小管）和睾丸间质，前者主要由生精细胞和支持细胞构成。生精细胞是精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子的总称，这些细胞依次从基膜向管腔方向移行、成熟并进入管腔的过程称为精子发生。睾丸是Se明确的重要靶组织之一，如磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx4）等硒蛋白对精子发生至关重要，它在精子发生初期发挥抗氧化酶的作用，而在成熟精子中则转变为失去酶活性的必需结构蛋白成分；Sepp1则是通过睾丸组织上皮的ApoER2受体，为睾丸提供大部分生理所需的Se；此外也有研究提示Seps1、Sep15、Txnrd3等硒蛋白在维持雄性生殖功能方面发挥重要作用。2010年，英国科学家发表的一篇论文显示：特异性分布于睾丸组织的Selv（，人类基因符号SELV，鼠类基因符号Selv）主要分布在精子发生晚期的中、晚期生精细胞，提示该蛋白在精子发生过程具有某种重要功能，但目前对其功能的认识仍属空白。 如前所述，Se是硒蛋白的结构成分，但缺Se时，并非所有组织、所有硒蛋白的表达都会受到影响。一些硒蛋白的mRNA在缺Se时表现出无义介导的降解（Nonsense-mediated decay，NMD）而致硒蛋白表达水平显著降低，但另有3条保持特定硒蛋白免受缺Se影响的等级法则：（1）脑与内分泌组织硒蛋白表达优先； （2）重要功能硒蛋白表达优先；（3）生殖性别差异硒蛋白表达优先。这些硒蛋白表达调控法则隐藏的机制是分子生物学相关基础研究的热点。睾丸Gpx4是同时满足上述3条等级法则的经典，膳食Se波动几乎不能影响其表达。部分原因可能是血睾屏障内具有携带Se功能的Sepp1能缓冲Se浓度波动，也可能是睾丸细胞中Gpx4等本身具有抵制Se水平影响的特殊机制。对睾丸生精细胞中特有的Selv，它的作用还有待揭示，而且，活体睾丸组织是否确实具有保持Selv表达免受外界Se水平波动影响的特殊能力，这也需要从mRNA转录与蛋白质表达水平加以证实。 当前，应用硒制剂防治硒缺乏病已经取得显著效果，但在治疗硒缺乏病时，由于盲目加大硒制剂的用药剂量，导致硒中毒时有发生。本研究通过动物实验，分析雄性大鼠在不同硒营养水平下，睾丸组织硒蛋白组的表达特征及其潜在功能，探索Se及硒蛋白在精子发生和雄性生殖健康中的作用，为防治Se及硒蛋白相关的男性不育疾病提供理论基础。 方法 1.实验方法 1.1实验分组设计 将30只4周龄雄性大鼠，以缺硒饲料饲喂5周，建立动物缺硒模型。随后按体重随机分为5组，每组6只大鼠，分别为：缺硒模型组（BD5w组）、缺硒对照组（BD9w组）、适硒组（BD+0.25ppm Se组，记为BD+0.25组），高硒组（BD+3.0ppm Se组，记为BD+3.0组），中毒硒组（BD+5.0ppm Se组，记为BD+5.0组）。BD5w组在9周龄时处死取样，余下4组以相应硒水平继续饲养4周。 1.2动物生长性能指标测定 每周监测动物体重；动物取样时，称量睾丸重量，并计算睾丸指数。 1.3大鼠组织、血细胞硒含量测定 采集心脏抗凝全血，离心得血细胞；分离睾丸、肝脏、肾脏等组织。所有样品经消化处理后，以电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定硒浓度。 1.4大鼠血浆8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的测定 按照试剂盒说明，测定大鼠血浆8-OHdG水平。 1.5大鼠精子质量和电镜观察 缺硒对照组、BD+0.25组、BD+3.0组、BD+5.0组等4组大鼠处死后，分离附睾尾，以精子获能液搜集各大鼠精子，显微镜下观察（×400）精子密度和精子活力，并录下视频；吸取1滴12%中性甲醛固定的精子悬液于载玻片上制备标本观察精子形态（×400）；离心精子悬液，得精子沉淀物，以2.5%戊二醛固定，常规电镜制片，透射电镜下观察精子超微结构。 1.6大鼠睾丸硒蛋白组基因的表达丰度测定（RT-qPCR） 微量匀浆器研磨小块睾丸组织后，加入RNAiso Plus试剂提取睾丸组织总RNA，制备cDNA第一链，以cDNA作模板，qPCR法检测睾丸硒蛋白基因组表达水平。 2.统计分析 采用SAS9.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(One WayAnova)，进一步作组间两两比较采用Bonferroni法。以P0.05为检验水准。 结果 1.硒对大鼠睾丸发育的影响 1.1硒对大鼠体重和睾丸指数的影响 大鼠饲喂缺硒和过量硒（3.0和5.0ppm Se）饲料可致大鼠生长缓慢，体重下降，体重增长速度由大到小为：BD+0.25组BD+3.0组BD+5.0组缺硒对照组；BD+5.0组的睾丸重和指数均稍高于其余3个染硒组，但差异没有统计学意义（P0.05），缺硒对照组、BD+0.25组、BD+3.0组3组睾丸重和指数没有显著差异（P0.05）。 1.2硒对大鼠组织硒含量的影响 大鼠缺硒可致睾丸、肝、肾、血细胞硒浓度明显降低，缺硒5、9周均低于适硒组（P0.05）；缺硒状态下，睾丸硒浓度明显高于肝、肾、血细胞（P0.05）；补充不同硒水平饲料后组织硒含量有所升高，其中肝、肾、血细胞中硒的蓄积浓度与染硒剂量呈明显正相关，随着染硒剂量的增加而迅速升高，而睾丸硒浓度随着染硒剂量的增加升幅较小，在3.0ppm Se以上染硒剂量时，睾丸硒浓度增速趋于平缓。 1.3硒对大鼠血浆8-OhdG水平的影响 各染硒组8-OHdG水平表现为：缺硒对照组BD+5.0组BD+3.0组BD+0.25组，其中缺硒对照组与BD+0.25组、BD+3.0组相比较，差异有统计学意义（P0.05），BD+0.25组、BD+3.0组、BD+5.0组3组间差异不显著（P0.05）。 2.硒对大鼠精子质量和超微结构的影响 2.1精子质量 精子密度：各硒干预组由高至低依次为：BD+0.25组BD+3.0组BD+5.0组缺硒对照组，其中BD+0.25组是缺硒对照组的1.75倍（P0.05），BD+3.0组是缺硒对照组的1.57倍（P0.05）。 精子活力：前向运动精子活力方面，BD+0.25组明显高于缺硒对照组（P0.05），BD+3.0组、BD+5.0组亦高于缺硒对照组，但差异没有统计学意义（P0.05）；非前向运动精子活力方面，缺硒对照组明显高于BD+0.25组、BD+3.0组、BD+5.0组（P0.05）；精子总活力方面，未发现缺硒对照组和3个补硒组间有显著差异（P0.05）。 精子形态：BD+5.0组精子畸形率最高，缺硒对照组其次，BD+0.25组和BD+3.0组结果相近。BD+5.0组和BD+0.25组、BD+3.0组比较，差异有统计学意义（P0.05），，与缺硒对照组比较，差异无统计学意义（P0.05）。 2.2精子超微结构 缺硒对照组（BD9w组）大鼠精核膜出现核周隙，顶体未见，精子中段细胞膜褶皱；线粒体部分区域排列紊乱，出现空隙，部分线粒体有明显空变。适硒组（BD+0.25组），精子头部精核膜完整，尾段胞膜完整光滑，线粒体呈同心圆排列，结构致密，大部分形态、大小正常，线粒体空变数量有所减少；轴丝和外周致密纤维规律排列整齐。高硒组（BD+3.0组），精子头部精核膜完整，顶体不明显，精子中段多见巨大线粒体，部分线粒体空变，最外层胞膜消失；精子尾段外围出现线粒体部分松解，界限不清。硒中毒组（BD+5.0组），精子头部细胞膜出现皱褶，顶体不明显，外周9条致密纤维部分缺失，精子中段细胞膜不清晰，线粒体大部分空变；精子尾段纤维鞘部分松散，线粒体丢失，细胞膜不清晰。总体来看，硒中毒组和缺硒对照组精子超微结构损伤最严重，高硒组次之。而适硒组虽然一定程度上恢复了缺硒所致的精子超微结构损伤，但仍存留有部分损伤不可恢复。 3.硒对大鼠睾丸硒蛋白组基因表达的影响 本试验采用RT-qPCR方法对大鼠睾丸组织硒蛋白组基因进行定量检测。研究结果显示，缺硒可致硒蛋白基因表达普遍下调，给予大鼠补充不同剂量的硒饲料后，共发现10个基因mRNA表达丰度上调，并且组间差异有统计学意义。其中，在BD+0.25组达到最高表达的基因有6个（Gpx1、SnGpx4、Txnrd2、Dio1、Seli、Sepn1），BD+3.0组3个（Selr、Sepp1、Sepw1），BD+5.0组1个（Txnrd1），组间表达差异达到2倍以上并且有统计学意义的基因有6个（Gpx1、SnGpx4、Txnrd1、Txnrd2、Seli、Selr），Txnrd1、SnGpx4、Selr是对硒调控最敏感的硒蛋白基因。 结论 1.硒缺乏和过量（3.0和5.0ppm Se）可致大鼠发育减缓，DNA氧化损伤，精子生成障碍，精子结构损伤、前向运动活力下降、畸形率升高，并且下调多个睾丸硒蛋白基因的表达； 2.补充0.25ppm Se饲料可改善大鼠发育状况，降低DNA氧化损伤程度，有效恢复精子结构损伤，提升精子质量，以及上调睾丸硒蛋白组基因表达； 3.大鼠在硒缺乏和过量状态下，睾丸硒蛋白表达异常可致精子质量下降，结构破坏。
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114

【参考文献】

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本文编号：1174519