重组人乳铁蛋白对一代延长试验大鼠免疫功能及神经行为影响的实验研究

发布时间：2017-11-21 02:10

  本文关键词：重组人乳铁蛋白对一代延长试验大鼠免疫功能及神经行为影响的实验研究

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【摘要】：目的:研究转人乳铁蛋白牛乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白(Recombinant human lactoferrin,rhLF)对子代大鼠免疫功能及神经行为的影响。本研究开展了重组人乳铁蛋白的一代延长试验,目的是丰富重组人乳铁蛋白的安全性评价资料,为风险管理和风险交流提供科学依据。方法:1.1重组人乳铁蛋白氨基酸组成检测及重组人乳铁蛋白饲料成分分析运用国标方法对重组人乳铁蛋白进行氨基酸分析。重组人乳铁蛋白全替换标准AIN-93G饲料中蛋白质作为重组人乳铁蛋白组饲料,标准AIN-93G饲料作为对照组饲料。饲料由北京华阜康饲料公司制作。由北京市营养源研究所对重组人乳铁蛋白组饲料及对照组饲料进行营养成分检测。1.2重组人乳铁蛋白对子代大鼠免疫功能的影响参照一代繁殖毒性扩展试验指南(OECD443)进行免疫功能试验,重点研究亲代大鼠在孕期和哺乳期暴露rhLF对子代大鼠免疫功能的影响,以及子代大鼠在断乳后持续暴露rhLF对其免疫功能的影响。选择PND0、PND21及PND56的子代大鼠进行相应的进行免疫功能评价。SPF级11周龄Wistar大鼠,雌鼠60只,雄鼠30只,适应环境一周后,随机分为对照组(酪蛋白)、重组人乳铁蛋白组,按照蛋白20%的比例掺入饲料进行全食物喂养。雌雄大鼠喂养相应饲料两周后进行交配,各组雌鼠在交配期、妊娠期和哺乳期继续给予相应饲料,子代大鼠从断乳到处死继续给予相应饲料。子代大鼠pnd0(出生后第0天)每窝随机选一只子代大鼠进行脾脏和胸腺淋巴细胞分型,保证每组20窝pnd0子代大鼠要有雌鼠10只、雄鼠10只。子代大鼠pnd4(出生后第4天),进行窝标准化,随机剔除多余子代大鼠,调整为8只/窝,雌雄各半[4],在pnd0、7、14和21称重。于pnd21子代大鼠断乳时,进行淋巴细胞分型(t/b/nk,cd3/cd4/cd8),每组20窝保证pnd21检测的子代大鼠中有雌鼠10只,雄鼠10只。子代大鼠于pnd56(出生后第56天)进行淋巴细胞分型和免疫功能评价试验。本研究参考人用药物免疫毒性试验指导原则(ichs8),选取了血常规;血生化;外周血、脾、胸腺及潘氏结淋巴细胞表型分析(cd3/cd4/cd8、t/b/nk);溶血空斑试验(pfc);淋巴细胞增殖试验;nk细胞活性试验等。指标涵盖了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫。1.3重组人乳铁蛋白对子代大鼠神经行为的影响1.3.1子代大鼠早期生理发育组合测试子代大鼠出生后以窝为单位,在出生后特定的天数检查子代大鼠成活率、性别比、出牙时间、耳廓分离时间、开眼时间和出毛时间等生理发育指标。1.3.2子代大鼠早期神经发育组合测试子代大鼠出生后以窝为单位,在出生后特定的天数检查子代大鼠平面翻正、悬崖回避、空中翻正、前肢悬挂、听觉惊吓等神经行为指标。各发育指标达标标准为:同窝所有子代大鼠该项指标均达标的天数。每组观察20窝。1.3.3子代大鼠感觉运动测试pnd28重组人乳铁蛋白组和对照组每窝随机挑选1只雄鼠或雌鼠(每组10只雄性和10只雌性)进行热板测试、转棒测试和抓力测试。1.3.4子代大鼠学习记忆行为学测试在pnd70分别从各组(重组人乳铁蛋白组和对照组)随机选取的雌雄大鼠各10只(每窝随机挑选1只雄鼠或雌鼠)进行morris水迷宫试验,对子代大鼠学习记忆行为进行评价,观察rhlf对子代大鼠学习记忆能力的影响。结果1.1重组人乳铁蛋白氨基酸含量和组成检测及重组人乳铁蛋白饲料成分分析对重组人乳铁蛋白与酪蛋白(casein,cas)的17种氨基酸进行定量测定。饲料营养成分分析检测结果表明,重组铁蛋白饲料和酪蛋白饲料的主要营养成分含量接近。1.2重组人乳铁蛋白对子代大鼠免疫功能的影响与对照组比较,重组人乳铁蛋白组子代大鼠血常规、血生化和淋巴细胞分型结果未见明显改变;溶血空斑试验(pfc)、淋巴细胞增殖试验及nk细胞活性试验,差异无统计学意义(p0.05)。1.3重组人乳铁蛋白对子代大鼠神经行为的影响1.3.1子代大鼠早期生理和神经发育指标子代大鼠出生后子代大鼠以窝为单位,检查了子代大鼠早期生理发育指标(成活率、性别比、出牙时间、耳廓分离时间、开眼时间和出毛时间)和早期神经发育指标(平面翻正、悬崖回避、空中翻正、前肢悬挂),检查结果显示,测试结果显示rhlf组和对照组之间比较,差异均无统计学意义(p0.05)。1.3.2子代大鼠感觉运动测试选择伤害性知觉测试(热板试验)、平衡能力测试(转棒试验)、抓力测试于pnd28对子代大鼠进行了感觉运动行为学测试,测试结果显示rhlf组和对照组之间比较,差异均无统计学意义(p0.05)。1.3.3子代大鼠学习记忆测试通过morris水迷宫试验,分析重组人乳铁蛋白对子代大鼠学习记忆能力的影响,未发现重组人乳铁蛋白对子代大鼠学习记忆功能有不良影响(p0.05)。结论1.与对照组比较,重组人乳铁蛋白组子代大鼠血常规、血生化和淋巴细胞分型结果未见明显改变;溶血空斑试验(pfc)、淋巴细胞增殖试验及NK细胞活性试验,差异无统计学意义(P0.05)。在本研究条件下,重组人乳铁蛋白对子代大鼠免疫功能未见不良影响。2.本论文结合一代繁殖毒性扩展试验指南,研究rhLF暴露对子代大鼠神经行为的影响,与对照组相比,未见重组人乳铁蛋白对子代大鼠神经发育指标、感觉运动功能和学习记忆能力的影响具有不良影响(P0.05)。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R151

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本文编号：1209303