以线粒体DLD蛋白为靶点研究重金属对Leydig细胞的毒性作用分子机制

发布时间：2017-11-25 20:02

  本文关键词：以线粒体DLD蛋白为靶点研究重金属对Leydig细胞的毒性作用分子机制

  更多相关文章： 重金属 睾丸间质细胞 二氢硫辛酰胺脱氢酶 类固醇激素

【摘要】：目的:以线粒体蛋白二氢硫辛酰胺脱氢酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,DLD)为靶点,研究重金属(铅、镉和锰)对睾丸间质细胞(Leydig细胞)的毒性作用,阐明其毒理机制,为重金属污染导致的男性性功能低下的治疗提供实验依据。方法:方法:采用灌胃的方式给予成年雄性SD大鼠铅暴露(10 mg/kg和25 mg/kg),给药时间为10 W;采用灌胃的方式给予成年雄性SD大鼠镉暴露(5 mg/kg和25 mg/kg),给药时间为7 W;采用腹腔注射的方式给予成年雄性SD大鼠锰暴露(5 mg/kg和10 mg/kg),给药时间为7 W。给药结束后,留取血液和睾丸组织进行检测。选用重金属铅(100μmol/L和500μmol/L)、镉(10μmol/L和20μmol/L)、锰(500μmol/L和1000μmol/L)作用于Leydig细胞株R2C细胞,并添加25μM的22-羟基胆固醇作为底物,24 h后收取培养上清和细胞。采用放射免疫法检测血清中睾酮和培养上清中孕酮的含量;通过Western blotting的方法分别检测类固醇激素合成酶的表达和c AMP-PKA/PKC-ERK1/2通路蛋白的表达及其磷酸化水平;应用流式细胞仪技术和免疫荧光技术检测Leydig细胞的线粒体膜电位。结果:为了验证重金属对DLD的下调作用,通过免疫组化和Western blotting的方法检测细胞和睾丸组织中DLD蛋白的表达。利用si RNA干扰技术,选用最佳干扰条件沉默R2C细胞中DLD的表达,用放射性免疫技术检测细胞培养上清中孕酮的含量,应用流式细胞仪技术检测线粒体膜电位,采用Western blotting法检测类固醇激素合成酶的表达和c AMP-PKA/PKC-ERK1/2通路相关蛋白的表达及其磷酸化水平,由此证实DLD与重金属抑制类固醇激素分泌毒性作用机制的相关性。结果:体内外实验结果显示,重金属能抑制Leydig细胞合成类固醇激素,下调类固醇激素合成关键酶St AR、CYP11A1和3β-HSD的蛋白表达,使细胞线粒体膜电位下降,同时显著下调PKA、PKC的蛋白表达和ERK1/2蛋白的磷酸化水平。不同重金属暴露后,Leydig细胞中DLD蛋白的表达水平明显下调。si RNA干扰技术沉默DLD表达后,R2C细胞的类固醇激素合成水平明显下降;线粒体膜电位没有变化;类固醇激素合成关键酶St AR和3β-HSD的蛋白表达也出现明显的下调趋势。更重要的是,由于DLD的表达沉默,c AMP-PKA-ERK1/2信号通路中,细胞内c AMP水平显著下降,PKA的表达下调,ERK1/2的磷酸化水平也同步下调。结论:结论:重金属暴露能显著抑制DLD蛋白的表达,通过抑制c AMP/PKA-ERK1/2信号通路的活化和类固醇激素合成关键酶St AR、CYP11A1和3β-HSD的表达,最终抑制类固醇激素的合成。通过si RNA干扰技术沉默DLD表达后,类固醇激素合成关键酶St AR和3β-HSD的蛋白表达也出现明显的下调,类固醇激素合成信号通路c AMP-PKA-ERK1/2的活化也受到抑制,最终同样导致了类固醇激素合成的下降。也就是说,在Leydig细胞中,DLD一方面可以作为c AMP上游的信号分子,调控c AMP/PKA-ERK1/2信号通路的活化,另一方面可以调控合成酶St AR和3β-HSD的蛋白表达来调节类固醇激素的合成;而重金属下调DLD蛋白的表达使其抑制类固醇激素合成,以及对Leydig细胞产生毒性效应的重要靶点。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 LIU Qing;GU Jian Hong;YUAN Yan;LIU Xue Zhong;WANG Ya Jun;WANG Han Dong;LIU Zong Ping;WANG Zong Yuan;BIAN Jian Chun;;Effect of Cadmium on Rat Leydig Cell Testosterone Production and DNA Integrity in vitro[J];Biomedical and Environmental Sciences;2013年09期

，

本文编号：1227192