花生过敏原酶联免疫分析方法的建立

发布时间：2017-11-26 03:24

本文关键词：花生过敏原酶联免疫分析方法的建立

【摘要】：本论文采用硫酸铵分级沉淀法提取制备了花生总蛋白和Ara h1过敏原蛋白,并免疫动物制备了兔、鼠多克隆抗体。针对花生总蛋白兔、鼠抗血清采用了免疫印迹法分析,证明兔多抗可识别分子量为63.5、61、57、17和15kDa的过敏原蛋白,鼠多抗可识别63.5、61、57kDa过敏原蛋白。优化建立了花生总蛋白的间接竞争酶联免疫方法,IC5o为1.18μg/mL。分别针对花生总蛋白和Ara h1过敏原蛋白优化建立了双抗体夹心酶联免疫分析方法。花生总蛋白的优化条件为：捕获抗体的包被量为0.075μg/孔,封闭液为0.5%脱脂乳粉,花生总蛋白从4μg/mL开始1.5倍梯度稀释,共7个梯度,检测抗体的稀释倍数为1：25000,HRP标记羊抗鼠二抗1：10000倍稀释,37℃显色20mmin,检测限为40.48ng/mL。且利用花生总蛋白抗体检测Ara h1过敏原蛋白,建立了双抗体夹心ELISA方法,检测限为8.38ng/mL。 Ara h1过敏原蛋白的优化条件为：捕获抗体的包被量为0.075μg/孔,封闭液为0.5%脱脂乳粉,Ara h1过敏原蛋白从1μg/mL开始2倍梯度稀释,共7个梯度,检测抗体的稀释倍数为1：40000,HRP标记羊抗鼠二抗1：10000倍稀释,37℃显色20mmin,检测限为1.38ng/mL。这两种双抗体夹心免疫检测方法与14种植物性蛋白均没有交叉反应。这两种夹心ELISA方法的板间变异为2.02%-12.00%、板内变异为0.68%-4.56%,说明所建立的ELISA方法具有良好的重现性。选择饼干、面包和牛奶样品,分别采用花生总蛋白和Ara h1过敏原蛋白双抗体夹心ELISA方法检测,样品添加回收率分别达87.14%-154.80%、70.30～110.05%。
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R155.5

【参考文献】

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