磁性富集荧光法快速检测大肠杆菌的研究

发布时间：2017-12-09 16:04

  本文关键词：磁性富集荧光法快速检测大肠杆菌的研究

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【摘要】：随着全球工业的发展,环境污染和食品安全问题日趋严重。环境保护和食品安全己成为本世纪影响人类生存和发展的重要问题。肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic escherichia coli, EHEC)是人类食源性以及水源性病原体,食用被该菌污染的食物会导致腹泻和肠炎,严重时将导致出血性结肠炎和溶血性尿毒症综合症,甚至死亡。EHEC以大肠杆菌0157：H7血清型为代表菌株,呈暴发流行趋势,且不断发生变异。建立一种快速、准确、简便检测大肠杆菌的方法,对环境监测和临床医学流行病学诊断有现实意义。因此,为了研究大肠杆菌的高灵敏快速检测方法,本文建立了一种基于萘酰亚胺标记的DNA探针和磁性四氧化三铁氧化石墨烯分离的大肠杆菌0157：H7检测方法。实验结果表明,在一定条件下,0157：H7数量的对数值和荧光强度与空白值荧光强度的比值(F/F0)呈线性关系,线性范围150～1.5×106CFU/mL,经过富集后检出限可达100 CFU/mL。该方法灵敏度高,检出限低,耗时较短,操作简单,为致病菌的高灵敏检测提供了新思路。本文将标记了萘酰亚胺的ssDNA(单链DNA)作为捕获探针吸附在磁性氧化石墨烯表面,当目标ssDNA存在时,捕获探针与目标ssDNA部分杂交,利用磁场将目标ssDNA捕获并进行富集,去除原溶液,然后加入释放探针溶液完成杂交,形成完整双链,使标记了荧光的捕获探针从磁性氧化石墨烯的表面释放出来,通过测定溶液荧光强度可以实现大肠杆菌0157：H7的高灵敏检测。本文对合成的目标DNA T和培养的大肠杆菌0157：H7均进行了检测试验,前者用来初步探索实验的可行性并优化实验条件,后者作为本实验体系的应用,对大肠杆菌的检测进行进一步的探索。论文研究内容和取得的研究成果主要体现在以下几个方面：(1)本实验合成了水溶性良好、荧光强度稳定的N-羟乙基-4-N(氨乙基)-1,8-萘酰亚胺(4-N-aminoethyl-N-hydroxyethyl-1,8-naphthalimide, AHA)并将其作为磁性富集荧光法检测大肠杆菌的荧光剂,为本实验测量出良好的荧光信号强度提供保障。(2)使用荧光分光光度计定量测量溶液荧光强度,建立检测大肠杆菌的新体系。以合成目标DNA为待测物,对各项实验条件进行优化,具体包括杂交温度、杂交时间、吸附时间、MGN浓度、释放探针R浓度和富集倍数。在最优条件下,通过检测不同浓度待测物存在时的荧光强度,研究待测物浓度和荧光强度之间的线性关系。(3)培养大肠杆菌0157：H7细菌溶液,通过平板菌落计数法确定其细菌数量,并用试剂盒提取其DNA,用以作为待测物,建立了对大肠杆菌检测的新方法,并检测该方法的灵敏度和实际应用性。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R155.3
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本文编号：1270984