赭曲霉毒素A诱导HEK293T细胞氧化应激及自噬研究
本文关键词： 赭曲霉毒素A 自噬 氧化损伤 ATM/LKB1/AMPK 出处：《遵义医学院》2017年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：目的:探讨赭曲霉毒素A(OTA)诱导的肾细胞(HEK293T细胞)氧化应激以及该过程与自噬的关系。方法:以HEK293T细胞为实验对象,通过OTA对细胞进行染毒,运用CCK-8增强型试剂盒对细胞活性进行检测;运用活性氧检测试剂盒检测ROS表达水平;通过Western blot检测自噬通路中关键蛋白(p-ULK1、p-Beclin1、p-mTOR、LC3-B)和氧化应激相关蛋白(ATM/LKB1/AMPK通路及TRAP1、VDAC1和LONP1)的表达情况。结果:1.OTA处理HEK293T细胞24小时后CCK-8结果表明:与对照组(不予以任何处理)相比1μM、3μM和5μM组均促进细胞生长,细胞存活率分别是105.1%、121.7%和121.3%;7μM、8μM、9μM及10μM组表现为抑制细胞生长,其中7μM组细胞存活率为89.6%,8μM组细胞存活率为49.4%,9μM组细胞存活率为10.5%,10μM组细胞存活率为5.7%。2.Western blot检测自噬相关蛋白结果显示OTA处理组中p-ULK1、p-Beclin1以及LC3B蛋白的表达明显高于对照组(不予以任何处理),该结果表明OTA诱导了HEK293T细胞自噬的发生,且8μM组自噬发生的水平高于7μM组。同时,8μM组及7μM组TRAP1、VDAC1和LONP1蛋白表达均明显低于对照组(不予以任何处理)。表明7μM和8μM OTA处理HEK293T细胞抑制了TRAP1、VDAC1和LONP1蛋白的表达。3.活性氧检测试剂盒检测结果表明OTA诱导细胞ROS水平升高,其中8μM组ROS荧光强度(?)=138.33,7μM组ROS荧光强度(?)=37.70,对照组(不予以任何处理)荧光强度(?)=1.36。4.与对照组(不予以任何处理)比较8μM组p-ATM、p-LKB1和p-AMPK蛋白表达明显增高,7μM组p-ATM、p-LKB1和p-AMPK蛋白的表达无明显变化,该结果表明8μM OTA诱导细胞氧化应激激活了ATM/LKB1/AMPK信号通路。5.与对照组(不予以任何处理)比较7μM组p-mTOR蛋白表达无明显变化,8μM组p-mTOR蛋白的表达明显低于对照组(不予以任何处理)。结论:(1)OTA处理诱导了HEK293T细胞氧化应激的发生,并且诱导了自噬发生,其中8μM处理诱导的氧化应激进一步激活ATM/LKB1/AMPK信号通路。(2)OTA处理抑制了HEK293T细胞TRAP1蛋白、LONP1蛋白及VDAC1蛋白的表达。
[Abstract]:Objective: to investigate the oxidative stress induced by ochratoxin (ACTA) in renal cell line HEK293T and its relationship with autophagy. Methods: HEK293T cells were used as experimental subjects. The cells were poisoned by OTA and the activity of the cells was detected by CCK-8 enhanced kit. The expression of ROS was detected by reactive oxygen species assay kit. Western blot was used to detect p-ULK1, p-Beclin1 and p-mTOR in autophagy pathway. LC3-B) and oxidative stress-related protein, ATM / LKB1 / AMPK pathway and TRAP1. The expression of VDAC1 and LONP1. Results: 1. The CCK-8 of HEK293T cells treated with OTA for 24 hours showed that it was not treated with any treatment. Compared with 1 渭 M. The cell growth was promoted in 3 渭 M and 5 渭 M groups, the cell survival rate was 105.1% and 121.3%, respectively. The cell growth was inhibited in 7 渭 M 8 渭 M 9 渭 M and 10 渭 M groups. The cell survival rate of 7 渭 M group was 89.6 渭 M and the cell survival rate of 8 渭 M group was 49.4%. The cell survival rate of 9 渭 M group was 10.5%. The cell survival rate of 10 渭 M group was 5.7. 2. The results of the detection of autophagy associated protein by Western blot showed that p-ULK1 was in the OTA treatment group. The expression of p-Beclin1 and LC3B protein was significantly higher than that of the control group (without any treatment), which indicated that OTA induced autophagy of HEK293T cells. The level of autophagy in 8 渭 M group was higher than that in 7 渭 M group, and TRAP1 in 8 渭 M group and 7 渭 M group was higher than that in 7 渭 M group. The expression of VDAC1 and LONP1 protein was significantly lower than that of the control group (no treatment was given, indicating that 7 渭 M and 8 渭 M OTA treatment of HEK293T cells inhibited TRAP1. The expression of VDAC1 and LONP1 protein. 3. The results of reactive oxygen species detection kit showed that OTA induced the increase of ROS level, especially in 8 渭 M group, ROS fluorescence intensity? Fluorescence intensity of ROS in 138.33 渭 M group? The fluorescence intensity of the control group (without any treatment) was 37. 70? Compared with the control group (without any treatment), the expression of p-ATMN p-LKB1 and p-AMPK protein in 8 渭 M group was significantly higher than that in the control group (7 渭 M group), and the expression of p-AMPK protein in 7 渭 M group was significantly higher than that in 7 渭 M group. The expression of p-LKB1 and p-AMPK protein did not change significantly. The results showed that 8 渭 M OTA induced oxidative stress activated ATM/LKB1/AMPK signaling pathway. 5. There was no significant change in p-mTOR protein expression in 7 渭 M group. The expression of p-mTOR protein in 8 渭 M group was significantly lower than that in the control group (no treatment was given). And induced autophagy. The oxidative stress induced by 8 渭 M further activated the ATM/LKB1/AMPK signaling pathway. OTA treatment inhibited the TRAP1 protein in HEK293T cells. Expression of LONP1 protein and VDAC1 protein.
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R114
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，本文编号：1452925
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