重组TNF-α人源单克隆抗体对食蟹猴长期毒性及机制研究

发布时间：2018-01-30 19:07

  本文关键词： 重组TNF-α人源单克隆抗体 毒性靶器官 长期毒性 免疫毒性 胸腺萎缩 脾脏萎缩 重组TNF-α人源单克隆抗体 T细胞发育 细胞凋亡 细胞增殖　出处：《第二军医大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分重组TNF-α人源单克隆抗体的长期毒性研究 目的：本实验观察食蟹猴皮下注射重组TNF-α人源单克隆抗体，每周一次，连续四周的毒性相关反应，和停药四周后恢复的情况。方法：30只正常食蟹猴随机按体重分为5个组：溶媒对照组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。每个剂量组6只动物，雌雄各3只。低、中、高剂量组分别给予10.0、33.0和200.0mg/kg的重组TNF-α人源单克隆抗体；阳性对照组给予33.0mg/kg的阿达木单抗（HUMIRA）；溶媒对照组给予重组TNF-α人源单克隆抗体空白溶液。各组动物按体重皮下注射给药，给药体积4ml/kg，每周给药一次，共4次，恢复期四周。观察症状和检测指标包括：（1）一般症状及指标：观察食蟹猴的外观，皮毛，行为，活动，步态，精神，食欲，有无流涎，恶心，大、小便，呕吐，有无死亡、震颤等。一般指标包括体重、肛温、呼吸、瞳孔共4项。（2）血液学指标：粒细胞（NEUT）、嗜酸性细胞（EOS）、嗜碱性细胞（BASO）、大未染色细胞（LUC）、红细胞压积（HCT）、血小板（PLAT）计数、凝血酶时间（TT）、红细胞平均容积（MCV）、红细胞平均血红蛋白含量（MCH）、单核细胞（MONO）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间(PT)、淋巴细胞（LYMPH）、红细胞（RBC）计数、白细胞（WBC）计数、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、网织红细胞（RETIC）、血红蛋白（HGB）定量和血浆纤维蛋白原（FIB）共19项[1]。（3）血液生化指标：血糖（GLU）、总胆红素（TBIL）、肌酐（CREA）、碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆固醇（Tch）、尿素（BU）、白蛋白（ALB）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、总蛋白（TP）、肌酸磷酸激酶（CPK）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、尿酸（UA）、血清钙（Ca）、甘油三脂（TG）、血清磷（P）、血清钾（K）、钠（Na）和氯（Cl）共检测20项[2]。（4）尿液检查项目[1]：pH、蛋白质、酮体、比重、红细胞、葡萄糖、白细胞、亚硝酸盐、尿胆原和胆红素。（5）骨髓检查：解剖的全部食蟹猴取胸骨进行骨髓细胞计数及分类。（6）病理学检查：给药和观察期结束后解剖，需要当场称重的器官有心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、脑、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾、子宫和卵巢，需要进行观察是否有病变的器官有给药部位、脑（大脑、小脑、脑干）、垂体、眼球、视神经、颌下腺、甲状腺、甲状旁腺、脊椎（颈、胸、腰段）、胸骨、气管、食管、主动脉、心脏、胸腺、肺脏、肝脏、胃、肾上腺、肾脏、小肠（十二指肠、空肠、回肠）、脾脏、胰腺、肠系膜淋巴结、坐骨神经、前列腺、膀胱、睾丸、附睾、子宫、卵巢、乳腺、大肠（结肠、直肠、盲肠）[2]。结果：（1）药物对食蟹猴的体重、肛温、呼吸和瞳孔无明显影响。（2）药物引起RBC、HGB、HCT降低，RETIC%升高，恢复期时可恢复正常，提示药物对猴血液学指标有一定的影响，其他血液学指标未见与给药相关的明显变化。（3）药物没有引起血液生化指标的明显变化。（4）药物对尿液指标没有造成一定的影响。（5）骨髓细胞检查结果表明，药物对食蟹猴骨髓细胞中的红细胞系有不同程度的刺激增生作用。（6）病理学检查发现，药物引起食蟹猴胸腺和脾脏萎缩，以及胸腺、脾脏淋巴细胞减少，恢复期时有恢复趋势；药物引起动物骨髓红细胞系轻度增生，恢复期结束，，各组未见明显病理改变。结论：重组TNF-α人源单克隆抗体长期给药对食蟹猴有明显的免疫毒性，能够引起免疫器官胸腺和脾脏的萎缩；药物可能存在血液系统毒性，可能引起机体贫血；药物对免疫系统、血液系统的毒性作用可逆。 第二部分重组TNF-α人源单克隆抗体免疫毒性机制研究 目的：探讨重组TNF-α人源单克隆抗体引起食蟹猴胸腺和脾脏萎缩的可能机制。方法：食蟹猴皮下注射重组TNF-α人源单克隆抗体10.0、33.0和200.0mg/kg，阳性对照组皮下注射33.0mg/kg的阿达木单抗（HUMIRA），溶媒对照组皮下注射等体积的重组TNF-α人源单克隆抗体空白溶液，每周给药一次，连续四周，恢复期四周。给药结束及恢复期结束进行下列试验：（1）重组TNF-α人源单克隆抗体对食蟹猴胸腺和脾脏细胞凋亡的影响试验；（2）重组TNF-α人源单克隆抗体对食蟹猴胸腺细胞细胞周期的影响试验；（3）重组TNF-α人源单克隆抗体对食蟹猴胸腺细胞增殖的影响试验；（4）重组TNF-α人源单克隆抗体对食蟹猴胸腺细胞发育的影响试验；（5）外周血T淋巴细胞表型（CD3/CD4/CD8）测定试验。结果：（1）胸腺细胞hoechest染色结果表明，包括阳性对照组在内的各给药组hoechest阳性细胞比例与溶媒对照组相比没有明显差异；胸腺TUNEL染色结果表明，阳性对照组及各给药组TUNEL阳性染色细胞比例与溶媒对照组相比没有明显差异。以上结果提示，重组TNF-α人源单克隆抗体长期给药未引起胸腺及脾脏细胞凋亡。（2）体外培养胸腺细胞的细胞周期检测结果表明，重组TNF-α人源单克隆抗体将胸腺细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期；（3）体外培养胸腺细胞的细胞增殖试验结果表明，重组TNF-α人源单克隆抗体引起EdU阳性细胞比例的显著下降，表明重组TNF-α人源单克隆抗体抑制了胸腺细胞的增殖；（4）药物对食蟹猴胸腺细胞发育的影响试验表明，阿达木单抗及各剂量的重组TNF-α人源单克隆抗体给药后引起胸腺细胞和脾细胞数量的明显减少，但CD4 CD8 、CD4+CD8+、CD4+、CD8+胸腺细胞的比例在各给药组与溶媒对照组之间没有明显差异；（5）外周血T淋巴细胞表型检测试验结果提示，各给药组的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞比例及CD4+/CD8+比值均与溶媒对照组没有显著差异。结论：（1）重组TNF-α人源单克隆抗体引起食蟹猴胸腺和脾脏萎缩可能与其抑制细胞增殖有关，与凋亡机制无关。（2）重组TNF-α人源单克隆抗体引起胸腺细胞数量减少，但各阶段胸腺细胞的比例没有明显变化，推测药物影响了T细胞发育的早期，即双阴性阶段，抑制了该阶段胸腺细胞的增殖，但对后继发育阶段没有影响。这一推测需进一步实验验证。
[Abstract]:Study on the Long - term Toxicity of Monoclonal Antibodies Against the Recombinant TNF - 伪 Human Source in the First Part Objective : To observe the effects of subcutaneous injection of recombinant TNF - 伪 human monoclonal antibody , once a week , four weeks of toxicity - related reactions and four weeks of withdrawal . Methods : 30 normal cynomolgus monkeys were randomly divided into 5 groups : vehicle control group , positive control group , high - dose group , middle - dose group and low - dose group . ( 3 ) Blood biochemical indexes : blood sugar ( GLU ) , total bilirubin ( TBIL ) , creatinine ( CREA ) , alkaline phosphatase ( ALP ) , alanine aminotransferase ( ALT ) , total cholesterol ( Tch ) , urea ( BU ) , albumin ( ALB ) , aspartate aminotransferase ( AST ) , total protein ( TP ) , uric acid ( UA ) , serum calcium ( Ca ) , triglyceride ( TG ) , serum phosphorus ( P ) , serum potassium ( K ) , white blood cell , nitrite , urobilinogen and bilirubin . ( 6 ) pathological examination : after the end of the dosing and observation period , organs weighing in the field are required to have heart , liver , spleen , lung , kidney , brain , adrenal gland , thymus , testis , appendix , uterus and ovary , and the organs with pathological changes need to be observed whether there are pathological organs , such as pituitary , eyeball , optic nerve , submaxillary gland , thyroid gland , parathyroid , spinal ( cervical , thoracic , lumbar ) , sternum , trachea , esophagus , aorta , heart , thymus , lung , liver , stomach , adrenal gland , kidney , small intestine ( duodenum , jejunum , ileum ) , spleen , pancreas , mesenteric lymph nodes , sciatic nerve , prostate , urinary bladder , testis , appendix , uterus , ovary , mammary gland , large intestine ( colon , rectum , cecum ) . Results : ( 1 ) There was no significant effect on the body weight , anal temperature , respiration and pupil of cynomolgus monkeys . Study on the Immune Toxicity Mechanism of the Recombinant Human Monoclonal Antibody Against TNF - 伪 in the Second Part 绌

本文编号：1477007