叶酸对体外神经干细胞分化作用机制的研究
本文关键词： NSC 分化 DNA甲基化 叶酸 出处：《天津医科大学》2013年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：目的 本实验主要研究叶酸(Folic acid)对体外培养神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化方向的影响,探讨叶酸基于DNA甲基化途径调控NSCs分化的机制。为NSCs移植和定向分化提供科学依据。 方法 采用无血清细胞培养法,培养新生大鼠海马NSCs,用SOX2和BrdU免疫荧光双标鉴定,并将NSCs分为5组：①对照组(folic acid-free differentiation medium, Control),②低叶酸组(low folic acid,8μg/mL, FA-L),③高叶酸组(high folic acid,32μg/mL, FA-H),④低叶酸加甲基阻断剂组(8μg/mL folic acid and150nmol/mL zebularine, FAL-Z),⑤高叶酸加甲基阻断剂组(32μg/mL folic acid and150nmol/mL zebularine, FAH-Z)。在分化第1天加甲基阻断剂作用,48h后换正常培养液,收集分化第6天细胞。分别采用免疫荧光(Immunofluorescent, IF)和免疫印迹(Western Blot)检测神经元的特异性标志物β-tubulin Ⅲ和星形胶质细胞的特异性标志物GFAP的表达；采用DNA甲基化定量试剂盒检测不同叶酸浓度下细胞总甲基化水平；甲基转移酶活性检测试剂盒检测DNMTs总活性,Western Blot检测DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的蛋白表达；用高效液相法(HPLC)检测细胞内S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine, SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(s-adenosylhomocysteine, SAH)的水平；Western Blot检测JAK-STAT通路中信号转导和转录激活因子STAT(Signal transducers and activators of transcription, STAT)中STAT1和STAT3的磷酸化水平；采用MeDIP-qPCR(甲基化DNA免疫共沉淀-实时定量PCR)检测GFAP基因启动子的甲基化水平。 结果 采用无血清培养法体外细胞培养6d后,细胞聚集成球形团块,边缘发亮,折光性强,呈悬浮状态,经SOX2和BrdU免疫荧光双标记法鉴定呈双阳性。体外诱导分化后,免疫荧光标记和Western Blot检测结果显示：与对照组相比,低叶酸组和高叶酸组的β-tubulin Ⅲ阳性表达率均增加,GFAP的阳性表达率均减少,低叶酸加甲基阻断剂组和高叶酸加甲基阻断剂组β-tubulin Ⅲ阳性表达率均减少,GFAP的阳性表达率均增加,差异均有统计学意义(P0.05)；低叶酸加甲基阻断剂组与低叶酸组相比,低叶酸加甲基阻断剂组β-tubulin Ⅲ阳性表达率下降,GFAP阳性表达率增加,差异均有统计学意义(P0.05)；高叶酸加甲基阻断剂组与高叶酸组相比,高叶酸加甲基阻断剂组P-tubulin III阳性表达率下降,GFAP阳性表达率增加,差异均有统计学意义(P0.05)o DNA,总甲基化水平检测结果显示：与对照组相比,低叶酸组和高叶酸组细胞总甲基化水平均增加,且高叶酸组总甲基化水平高于低叶酸组,差异均有统计学意义(P0.05)。DNMTs总活性检测结果显示：与对照组相比,低叶酸组和高叶酸组的DNMTs总活性均增强,低叶酸加甲基阻断剂组和高叶酸加甲基阻断剂组的DNMTs总活性均降低,差异均有统计学意义(P0.05)；低叶酸加甲基阻断剂组与低叶酸组相比,低叶酸加甲基阻断剂组DNMTs总活性显著降低,高叶酸加甲基阻断剂组与高叶酸组相比,高叶酸加甲基阻断剂组DNMTs总活性下降,且高叶酸加甲基阻断剂组DNMTs总活性高于低叶酸加甲基阻断剂组,差异均有统计学意义(P0.05)。Western Blot检测DNMTs的蛋白表达,结果显示：与对照组相比,DNMT1和DNMT3a的蛋白表达在低叶酸组和高叶酸组均增加,DNMT3b的蛋白表达仅在高叶酸组增加,差异均有统计学意义(P0.05)。HPLC检测结果显示：与对照组相比,低叶酸组和高叶酸组的SAM水平升高,SAH的水平降低,SAM/SAH的比值增加,差异均有统计学意义(P0.05)。Western Blot检测p-STAT1, p-STAT3表达,结果显示：与对照组相比,高叶酸组p-STAT3的表达下降,差异有统计学意义(P0.05); p-STAT1在各组中的表达无显著改变,差异无统计学意义(P0.05)。MeDIP-qPCR检测结果显示：与对照组相比,低叶酸组和高叶酸组GFAP基因启动子甲基化水平升高,且高叶酸组高于低叶酸组,差异均有统计学意义(P0.05)。 结论 本实验结果显示,叶酸减少体外神经干细胞向神经胶质方向分化,进而增加向神经元方向分化比例。其可能的机制是：叶酸通过增加DNMT1, DNMT3a/3b蛋白的表达提高DNMTs总活性水平,通过改变甲基化途径中关键代谢物SAM和SAH浓度,促进甲基化反应的发生,提高星形胶质细胞GFAP基因启动子的甲基化水平,同时降低p-STAT3的表达,协同抑制NSCs向星形胶质细胞的分化,从而提高神经元的分化比例。
[Abstract]:objective
The aim of this study is to investigate the effect of folic acid (Folic acid) on the differentiation direction of neural stem cells (NSCs) in vitro, and to explore the mechanism of folic acid regulating NSCs differentiation based on DNA methylation pathway. It will provide a scientific basis for NSCs transplantation and directional differentiation.
Method
Cell culture in serum-free medium, cultured NSCs neonatal rat hippocampus, using SOX2 and BrdU immunofluorescence identification, NSCs was divided into 5 groups: control group (folic acid-free, differentiation medium, Control), low folic acid group (low folic acid, 8 g/mL, FA-L), the high folic acid group (high folic acid, 32 g/mL, FA-H), the low folic acid and methyl blocker group (8 g/mL folic acid and150nmol/mL zebularine, FAL-Z), the high folic acid and methyl blocker group (32 g/mL folic acid and150nmol/mL zebularine, FAH-Z). The antagonist role in differentiation of first days after 48h for normal methyl. The culture medium, collected sixth days. Cell differentiation were detected by immunofluorescence (Immunofluorescent, IF) and immunoblotting (Western Blot) to detect neuron specific markers of beta -tubulin III and astrocyte specific marker GFAP expression by DNA methylation set; The amount of kit for detection of cell total methylation in different concentration of folic acid level; methyltransferase activity detection kit to detect DNMTs activity, Western Blot detection of DNA methyltransferase (DNA methyltransferases DNMTs) protein expression; by high performance liquid chromatography (HPLC) detection of S- intracellular S-adenosylmethionine (S-adenosylmethionine, SAM). S- adenosylhomocysteine (S-adenosylhomocysteine, SAH) level; Western Blot JAK-STAT signal pathway transduction and transcription factor STAT (Signal transducers and activators of transcription, STAT) STAT1 and STAT3 phosphorylation; using MeDIP-qPCR (methylated DNA immunoprecipitation - real-time quantitative methylation of GFAP PCR) gene promoter.
Result
Using the serum-free culture method of cell culture in vitro after 6D cell aggregation of spherical agglomerates, edge illuminated, strong refraction, a suspended state, by SOX2 BrdU and immunofluorescence method to identify a double positive. In vitro differentiation, immunofluorescence and Western Blot detection results showed that: compared with the control group, low folic acid group and high folic acid group III beta -tubulin positive expression rate was increased, the positive rate of GFAP were reduced, low folic acid and methyl blocker group and high folic acid and methyl group beta blocker of -tubulin positive expression rate decreased, GFAP positive expression rate was increased, the differences were statistically significant (P0.05); low folic acid and methyl blockers compared with low folate group, low folic acid and methyl beta blocker group III -tubulin positive expression rate decreased, the positive expression rate of GFAP increased, the differences were statistically significant (P0.05); high leaf acid and methyl block Compared with the high dose group high folic acid group, folic acid and methyl blockers P-tubulin III positive expression rate decreased, the positive expression rate of GFAP increased, the differences were statistically significant (P0.05 o DNA), the total methylation level. The results showed that: compared with the control group, low folate group and high folate group cell total methylation average increased, and high folic acid group the total methylation level lower than that of the folic acid group, there were statistically significant differences in the total activity of.DNMTs (P0.05). The results showed that: compared with the control group, low folic acid group and the total activity of DNMTs is high in folic acid group were enhanced, low folic acid and methyl blocker group and high folic acid and methyl blocker group the total activity of DNMTs decreased, the differences were statistically significant (P0.05); low folic acid and methyl blockers compared with low folate group, low folic acid and methyl blocker group total DNMTs activity decreased significantly, high folic acid and methyl blockers and high leaf Acid group, high folic acid and methyl blocking agent group decreased DNMTs activity, and high folic acid and methyl blocker group the total activity of DNMTs was higher than that of low folic acid and methyl blocker group, there were statistically significant differences in the expression of.Western Blot (P0.05), the detection of DNMTs protein results showed that: compared with the control group, the expression of DNMT1 and DNMT3a the protein increased in low folate group and high folic acid group, the expression of DNMT3b protein was increased in high folic acid group, the differences were statistically significant (P0.05.HPLC). The results showed that: compared with the control group, low folate group and high folate group SAM level increased, the lower the level of SAH, increase the SAM/SAH ratio. There were statistically significant differences (P0.05).Western Blot detection of p-STAT1, p-STAT3 expression, results showed that: compared with the control group, decreased expression of high folic acid group p-STAT3, the difference was statistically significant (P0.05); the expression of p-STAT1 in each group no There was no significant difference in the significant change (P0.05)..MeDIP-qPCR test results showed that compared with the control group, the methylation level of GFAP gene promoter in folate group and folate group increased, and the folate group was higher than that in the low folate group, the difference was statistically significant (P0.05).
conclusion
The experimental results show that the reduction of folic acid in vitro of neural stem cells to glial differentiation, and differentiate into neurons increased. The possible mechanism is that folic acid by increasing the DNMT1 expression of DNMT3a/3b protein increased the total activity of DNMTs level, by changing the methylation pathway in key metabolites SAM and SAH concentration, promote the occurrence of the reaction of methyl the level of methylation increased astrocytic GFAP gene promoter, and reducing the expression of p-STAT3 differentiation, synergistic inhibition of NSCs to astrocytes, thereby enhancing neuronal differentiation ratio.
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R151.2
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 姬长珍;黄国伟;张文治;苏心;;叶酸对体外胎鼠神经干细胞增殖分化的影响[J];卫生研究;2007年05期
2 王广雷;黄国伟;张绪梅;丛革新;姬长珍;田志红;;叶酸对胎鼠大脑神经干细胞增殖蛋白表达影响[J];中国公共卫生;2008年04期
3 尤清菊;张绪梅;刘欢;杨阳;赵琳;刘佳杰;黄国伟;;叶酸对缺氧新生鼠神经干细胞体外增殖的影响[J];天津医科大学学报;2009年04期
4 赵琳;张绪梅;刘欢;杨阳;尤清菊;刘佳杰;黄国伟;;叶酸对体外缺氧新生大鼠神经干细胞Hes5基因表达的影响[J];天津医科大学学报;2010年01期
5 张楠;;叶酸缺乏可加促酗酒者的肝损伤[J];国外医学情报;2003年04期
6 李艳华;妇女围受孕期增补叶酸预防胎儿神经管缺陷[J];中国妇幼保健;2005年14期
7 向建军,许榕仙;叶酸及同型半胱氨酸与心血管疾病研究进展[J];海峡预防医学杂志;2005年05期
8 张新华;樊春红;;抑郁症患者血清叶酸和维生素B12浓度研究[J];临床精神医学杂志;2006年01期
9 杨慧敏,孙轶,廖国仪,周冬,余灵,黄云祖,周天鸿;叶酸缺乏孕鼠子代血细胞形态学改变及脑额区皮层超微结构表现[J];中国小儿血液;2003年03期
10 刘芬;武文惠;;叶酸与胚胎停止发育的关系[J];中国优生与遗传杂志;2007年07期
相关会议论文 前10条
1 郝玲;;第七节 叶酸[A];中国营养学会DRIs修订专家委员会第二次会议样板稿汇编[C];2011年
2 郝玲;;第七节 叶酸[A];中国营养学会第二次膳食营养素参考摄入量研讨会汇编[C];2011年
3 张继军;石晓丽;王南平;;叶酸功能研究进展[A];营养与慢性病——中国营养学会第七届理事会青年工作委员会第一次学术交流会议论文集[C];2010年
4 孙一睿;胡锦;王尔松;奚才华;姚海军;;单层黏附培养技术在哺乳动物神经干细胞体外稳定增殖和多向分化中的应用[A];中国医师协会神经外科医师分会第四届全国代表大会论文汇编[C];2009年
5 文玉军;王登科;孙征;刘海洋;张莲香;秦毅;;成年和老年大鼠脑出血后海马齿状回神经干细胞的变化[A];中国解剖学会2011年年会论文文摘汇编[C];2011年
6 张波;王任直;;脑梗死后神经干细胞原位增殖及其机理的实验研究[A];中国微循环学会第五届中国微循环学术大会论文摘要汇编[C];2004年
7 李力;万琪;刘永红;张巍;;小鼠神经干细胞培养及缺血神经元对其增殖、分化的影响[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
8 田东萍;苏敏;吴贤英;张舸;;硒、B-27在神经干细胞球存活与分化中的作用[A];中华医学会病理学分会2005年学术年会论文汇编[C];2005年
9 杨华静;徐鹏;张苏明;;低浓度β-淀粉样蛋白对神经干细胞的作用机制研究[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年
10 邢雪松;吕威力;;Wnt-1在大鼠脑缺血再灌注海马组织内源性神经干细胞早期增殖分化中的作用[A];创新沈阳文集（B）[C];2009年
相关重要报纸文章 前10条
1 ;叶酸缺乏危及母子[N];保健时报;2004年
2 王敏;叶酸缺乏影响优生[N];江苏科技报;2001年
3 郑州大学一附院 王志铭;防痴呆多吃绿叶菜[N];健康时报;2010年
4 公共营养师 李靖婷;叶酸功能新发现[N];医药养生保健报;2006年
5 中南大学湘雅二医院老年外科 刘栋才;补叶酸防肠癌 时机仍是谜[N];健康报;2008年
6 靳晓方;体内缺乏叶酸可能得“怪病”[N];中国妇女报;2006年
7 王玉林;叶酸缺乏易致宫颈癌[N];大众卫生报;2007年
8 ;孕妇不要过量服用叶酸[N];农村医药报（汉）;2008年
9 记者 田雅婷;北京为孕妇免费增补叶酸[N];光明日报;2011年
10 本报记者 黄 丹;叶酸缺乏和神经管畸形[N];中国中医药报;2002年
相关博士学位论文 前10条
1 袁秋环;叶酸对胎鼠神经干细胞的影响及机制研究[D];山东大学;2013年
2 Jahidul Islam Shohag;蔬菜叶酸：检测技术，提高途径和基因型差异[D];浙江大学;2013年
3 赵梅;叶酸对细菌脂多糖诱发小鼠不良妊娠结局的保护作用[D];安徽医科大学;2013年
4 高茹菲;叶酸缺乏对子宫内膜容受性相关基因表达的甲基化调控及其对胚胎着床的影响[D];重庆医科大学;2012年
5 卢洪流;成年大鼠脑内神经干细胞的在体研究[D];第二军医大学;2001年
6 郑敏;神经干细胞定向分化与移植治疗帕金森病的实验研究[D];重庆医科大学;2003年
7 李巍;神经干细胞的分化调控及BDNF基因修饰后对大鼠脊髓损伤修复的研究[D];第三军医大学;2002年
8 张力;人胚神经干细胞及骨髓基质细胞移植治疗帕金森病恒河猴模型的实验研究[D];复旦大学;2003年
9 戴宜武;骨髓基质细胞定向分化为神经干细胞及自体移植治疗中脑损伤研究[D];第一军医大学;2002年
10 张所军;神经干细胞向胶质瘤干细胞迁移及对其生长特性的影响[D];华中科技大学;2011年
相关硕士学位论文 前10条
1 罗素慧;叶酸对体外神经干细胞分化作用机制的研究[D];天津医科大学;2013年
2 杨阳;叶酸通过MAPK通路对体外缺氧神经干细胞增殖作用的研究[D];天津医科大学;2010年
3 丛革新;叶酸对神经干细胞增殖分化相关信号中mRNA及蛋白表达的影响[D];天津医科大学;2007年
4 刘佳杰;叶酸对体外缺氧新生大鼠神经干细胞保护作用的研究[D];天津医科大学;2011年
5 薛芳;叶酸诱导骨髓间充质干细胞的体内外实验研究[D];山西医科大学;2010年
6 宋精梅;比较新生大鼠脑部不同部位的神经干细胞被诱导分化为少突胶质细胞的差异[D];福建医科大学;2010年
7 冯年花;人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的实验研究[D];南昌大学;2010年
8 李政;内皮祖细胞调控神经干细胞分化及其机制研究[D];第三军医大学;2010年
9 王念;绞股蓝皂苷对脊髓源神经干细胞体外培养的影响[D];陕西师范大学;2011年
10 刘朋;海藻酸钙/明胶微胶珠的制备及在神经干细胞培养中的应用[D];大连理工大学;2011年
，本文编号：1529125
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yufangyixuelunwen/1529125.html
