微囊藻毒素-LR对小鼠肝细胞DNA甲基化影响的体内实验研究

发布时间：2018-03-04 15:33

本文选题：微囊藻毒素-LR　切入点：甲基化　出处：《广西医科大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：研究微囊藻毒素-LR (Microcystin-LR, MCLR)短期重复暴露对小鼠肝细胞DNA总体甲基化水平、DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMTs)活性、蛋白及mRNA表达的影响,探讨MCLR诱导的肝毒性与DNA甲基化之间的关系。方法：80只健康昆明小鼠,随机分为2批,每批4组,每组10只,即对照组(含0.02%二甲基亚砜的生理盐水0.005ml/g)、MCLR低(5μg/kg)、中(10μg/kg)、高(20μg/kg)剂量组,每天1次称量体重并经腹腔注射染毒,两批分别染毒10天和20天。第11天和第21天处理小鼠,采血后称量肝脏重量,计算体重增长率及肝脏脏器系数；分离血清后,用全自动生化分析仪测定血清中谷丙转氨酶(Alanine Aminotransferase, ALT).谷草转氨酶(Aspartate Aminotransferase, AST).碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase, ALP).总蛋白、白蛋白及球蛋白的水平；取肝组织进行光镜下的病理检查；提取并水解肝细胞DNA,用高效液相色谱法对DNA总体甲基化水平进行测定；提取肝细胞核蛋白,用DNMTs酶活性测定试剂盒对DNA甲基转移酶活性进行测定；提取肝细胞总RNA,逆转录成cDNA,用实时荧光定量PCR法对DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA表达进行测定；提取肝细胞蛋白,用Western Blot法测定DNMT1的蛋白表达量。结果： 1.染毒10天和20天后,中、高剂量组体重增长率与对照组比较,均明显降低(P0.05)。染毒20天高剂量组脏器系数高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。 2.染毒10天低剂量组在ALT、AST、ALP水平上无明显变化(P0.05)。染毒10天和20天后中、高剂量组血清ALT水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。染毒10天高剂量组,染毒20天低、中、高剂量组AST水平均高于对照组(P0.05)。染毒10天和20天中、高剂量组ALP水平均高于对照组(P0.05)。染毒10天后,高剂量组总蛋白、白蛋白水平低于对照组(P0.05),染毒20天后,低、中、高剂量组总蛋白、白蛋白水平与对照组比较均降低(P0.05)。 3.肝脏病理检查发现染毒10天低剂量组未出现明显病理改变,高剂量组肝细胞出现肿胀,以及少量点状坏死,染毒20天后低剂量组细胞出现肿胀,中剂量组不仅细胞肿胀明显,且汇管区炎性细胞增多,枯否细胞肥大增生,高剂量组中双核细胞增多,并出现坏死灶。 4.染毒10天后,各剂量组DNA总体甲基化水平未出现明显变化。染毒20天中、高剂量组DNA总体甲基化水平为(2.26±0.60)%和(2.16±0.51)%,均低于对照组的(3.31±0.86)%,差异均有统计学意义(P0.05)。 5.染毒10天或20天后,各剂量组的DNMTs酶活性水平与对照组相比均有所上升,差异具有统计学意义(P0.05)。 6.染毒10天高剂量组DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的mRNA表达水平均下调(P0.05),染毒20天后,中、高剂量组中DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的mRNA表达水平与对照组比较均下降(P0.05),其中剂量组DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的mRNA表达水平分别降至对照组的38.3%、59.9%、21.5%,差异具有统计学意义(P0.05)。 7.染毒10天后,高剂量组DNMT1蛋白表达水平与对照组比较明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。染毒20天后,各剂量组DNMT1蛋白表达水平有降低的趋势,但差异无统计学意义(P0.05)。 8.血清AST、ALP水平与肝细胞DNA总体甲基化水平呈负相关关系(rAST=-0.29, P0.01; rALP=-0.40, P0.01),血清ALT水平与DNA总体甲基化水平之间未见明显相关关系(γ=-0.19,P=0.10)。肝细胞DNMT1、 DNMT3a、DNMT3b mRNA表达与DNA总体甲基化水平呈正相关关系(rDNMTI=47, P0.01; rDNMT3a=0.37, P0.01; rDNMT3b=0.36, P0.05)。结论： 1. MCLR短期重复暴露可致小鼠肝脏结构和功能损伤,表现为血清ALT、 AST和ALP水平升高,血清总蛋白、白蛋白水平降低,病理检查发现染毒后肝细胞出现肿胀,并出现坏死灶。 2. MCLR可抑制小鼠肝细胞DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的mRNA表达,抑制DNMT1的蛋白表达,降低DNA总体甲基化水平。 3. MCLR引起的肝损伤可能与甲基化异常有关,DNA总体甲基化水平的降低可能与DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的mRNA表达下调有关。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R114

【参考文献】