阿特拉津降解菌株中三嗪水解酶的鉴定及酶学研究

发布时间：2018-03-14 10:35

  本文选题：阿特拉津降解菌　切入点：三嗪水解酶　出处：《河北医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：阿特拉津（atrazine），商品名莠去津，是一种在世界范围内广泛使用的三嗪类除草剂。由于其在环境中稳定存在，不易降解，造成了生态环境的破坏，威胁到人类食品及饮用水的安全。阿特拉津降解菌株根据其降解基因的组成，可以分为三种类型，分别是atzABCDEF、trzN-atzBC和atzABC-trzD。trzN基因所编码的酶是trzN-atzBC降解途径中降解阿特拉津的第一个酶，称为三嗪水解酶。trzN基因比atzA基因在阿特拉津降解菌中更加普遍，并且具有更广的底物谱。因此，阿特拉津降解菌株中trzN基因的生物学功能具有重要的研究价值。 目的： 通过对四株阿特拉津降解菌株中三嗪水解酶基因trzN的比较研究，加深对trzN基因生物学功能的认识，为生物修复技术的发展提供理论储备。 方法： 1三嗪水解酶TrzN的表达与纯化 1.1表达载体和菌株的构建：用PCR方法扩增出三嗪水解酶基因trzN，连接至高效表达载体pET-28b(+)上，转化入E. coli BL21(DE3)，并添加分子伴侣。 1.2表达条件的优化：选择合适的L-(+)-Arabinose浓度、生长温度和IPTG浓度，优化表达条件，增加可溶性蛋白比例。 1.3保存条件的优化：选择最适的缓冲液、最适pH值以及缓冲液的浓度，最大限度的保存蛋白活性。 1.4纯化条件的优化：根据亲和层析的方法，用不同浓度咪唑洗脱缓冲液洗脱TrzN蛋白，纯化目的蛋白。 2三嗪水解酶TrzN酶学性质的比较研究 2.1最适反应条件的研究：测定蛋白活性与温度、pH值以及金属离子之间的关系。 2.2底物特异性的研究：研究TrzN降解不同底物的能力。 3酶动力学常数测定：测定并计算TrzN的K_m值和V_max值。 4三嗪水解酶TrzN在阿特拉津降解菌株中的分布：为了在蛋白水平上进一步确定筛选得到的阿特拉津降解菌株中是否含有trzN基因编码的三嗪水解酶TrzN，进行了western blot检测。我们将构建好的表达载体pET-21b(+)-trzN转化入E. coli BL21表达菌株中（trzN基因来自节杆菌TC1），制备兔多克隆抗体。用制备好的trzN抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记羊抗兔作为二抗，对各阿特拉津降解菌株进行western blot检测。 结果： 1三嗪水解酶TrzN的表达与纯化 1.1表达载体和菌株的构建：根据双酶切和基因测序结果证明高效表达载体pET28b(+)-trzN构建成功。 1.2TrzN的最适表达条件为：表达菌株生长至OD_(600)约为0.5时加入L-(+)-Arabinose至终浓度为0.015%，诱导表达1.5h，分别加入IPTG至终浓度1.5μmol·L~(-1)，15℃诱导表达16h，可溶蛋白表达量最大。 1.3TrzN的最适保存条件为：TrzN粗酶液在pH8.0的50mmol·L~(-1)磷酸钾缓冲液中酶活力的保持最好。 1.4纯化条件的优化：在咪唑浓度为200mmol·L~(-1)时目标蛋白被大量洗脱，并且不含杂蛋白。 2三嗪水解酶TrzN酶学性质的比较研究 2.1最适反应条件的研究：TrzN纯酶酶反应的最适pH值为8.0，，其在pH8.0的中性环境中比较稳定；TrzN纯酶在室温至30℃之间比较稳定，放置30min后酶活力降低较少，在40~50℃放置30min酶活力降低明显，在70℃放置30min酶完全失活；经研究表明Co~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(2+)、Ca~(2+)和Mg~(2+)对TrzN有激活作用，特别是Co~(2+)对酶的激活作用明显，Cu~(2+)和Ni~(2+)对酶有轻微抑制作用，使TrzN活性减弱。 2.2底物特异性的研究：TrzN酶有多底物活性，对ametryn的降解活性最高，dipropetry次之，而对prometryne、atratone和atrazine的降解活性相对较低。 3TrzN的酶动力学常数：四种不同阿特拉津降解菌株三嗪水解酶TrzN的K_m值和V_max值非常相近。米氏常数（K_m）和最大反应速度（V_max）分别约为42±10μmol·L~(-1)，172±10μmol·L~(-1)min~(-1)。4TrzN在阿特拉津降解菌中得分布：除Pseudomonas sp. ADP不能与TrzN蛋白抗体相结合外，其余25株阿特拉津降解菌株均与TrzN蛋白抗体发生免疫荧光反应。 结论： 1这四株阿特拉津降解菌株所表达的TrzN蛋白，降解活性无明显差异。 2除Pseudomonas sp. ADP不含有TrzN蛋白外，其余25株阿特拉津降解菌株中均含有TrzN蛋白。
[Abstract]:Atala Zin (atrazine), the commodity name of atrazine, is a widely used in the world within the scope of three triazine herbicides. Because of its stability in the environment, not easy to be degraded, resulting in the destruction of the ecological environment, the threat to human food and drinking water safety. Atala Zin Degradation Strain according to the composition of the degradation genes which can be divided into three types, namely atzABCDEF, trzN-atzBC and atzABC-trzD.trzN gene encoding the enzyme is the first enzyme degradation of Atala Zin trzN-atzBC in the degradation pathway, called three triazine hydrolase.TrzN gene than the atzA gene in a atrazine degrading bacteria is more common, and has a broad substrate spectrum. Therefore, biology the function of trzN gene in Atala Zin degrading strains has important research value.
Objective:
A comparative study of three azine hydrolase gene trzN in four atrazine degrading strains was made to deepen the understanding of trzN gene's biological function and provide theoretical reserve for the development of bioremediation technology.
Method锛

本文编号：1610828