茶氨酸对脑缺血再灌注大鼠单胺类神经递质及GluR2、PLC-γ1表达的影响

发布时间：2018-03-17 21:03

本文选题：缺血再灌注损伤　切入点：茶氨酸　出处：《复旦大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： L-茶氨酸(L-Theanine)是茶叶中一种特有的游离氨基酸,属酰胺类化合物,有甜味,是茶叶中生津润肺的主要成份。茶氨酸与谷氨酸结构相似,Kakuda~[1]等用放射性标记H原子示踪方法发现,茶氨酸能与中枢神经系统中主要兴奋性神经递质谷氨酸的离子型受体(NMDA、AMPA、KA受体)结合,并产生生物学效应。近年来茶氨酸对神经损伤的保护作用越来越受到人们的关注,沈慧等探讨了茶氨酸对脑缺血大鼠氨基酸类神经递质的影响,本研究主要从茶氨酸对脑缺血模型大鼠单胺类神经递质及PLC-γ1、谷氨酸受体GluR2mRNA表达的影响等方面进一步探讨茶氨酸对脑缺血再灌注所致神经损伤的保护作用机制。方法： 1.建立反相高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定大鼠脑内单胺类神经递质多巴胺(dopamine, DA)及五羟色胺(5-hydroxytry-ptamine,5-HT)含量的方法采用ODS-SP C_(18)色谱柱(4.6mmx250mm,粒径5μm),流动相为醋酸钠-柠檬酸缓冲液(含醋酸钠40mmol/L、柠檬酸30mmol/L、EDTA-2Na0.2mmol/L辛烷磺酸钠0.4mmol/L, PH3.8)：甲醇体积比比=70：30；荧光检测器的激发波长为280nm,发射波长为330nm：流速为1.0ml/min;柱温35℃；进样量20μl；整个色谱过程20min；采用标准曲线法,以色谱峰面积计算DA、5-HT含量。 2.茶氨酸对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用机制采用56只6周龄、体重为100～120g的SPF级雄性健康SD大鼠(复旦大学实验动物部提供：CXK(沪)2008-0016),适应性喂养3d后,按体重分层随机分为模型组、假手术组、茶氨酸低剂量组、中剂量组、高剂量组,茶氨酸低、中、高剂量组大鼠每天分别灌胃给予茶氨酸10、30、90mg/kg,模型组和假手术组每天灌胃给予等量超纯水。大鼠连续灌胃15天后,进行大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)手术,于脑缺血2h拔出栓线再灌注,假手术组除不插栓线外其余处理步骤与模型组相同。再灌注后第3、24小时对大鼠进行神经行为学评分。于再灌注后第24小时取缺血侧大脑,置于-80℃冰箱中待测定各组大鼠脑中茶氨酸及单胺类神经递质5-HT含量,GluR2mRNA和PLC-ylmRNA的表达以及线粒体活性氧(ROS)水平和过氧化氢酶(CAT)活力的变化。结果： 1.反相高效液相色谱法对大鼠脑内DA及5-HT含量的测定方法在上述色谱条件下,DA及5-HT的保留时间分别为4.39mmin和5.44mmin,两者峰型及分离良好,经前处理后脑组织样品中的其他成分对目标色谱峰无干扰。DA及5-HT在0.005-1.000ug/ml浓度范围内回归方程分别为Y=2.33×106X-1793和Y=9.06×106X+58081,相关系数分别为0.9998、0.9987。浓度为0.1、0.3、0.5ug/ml时,精密度实验显示各RSD均小于7%,加标回收率均大于80%。 2.茶氨酸对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用机制 2.1大鼠脑缺血再灌注3、24h神经行为学评分假手术组(n=8)大鼠术后无horner体征；各缺血组大鼠再灌注后3、24小时均出现不同程度的神经损伤体征。模型组(n=8)、茶氨酸低(n=8)、中(n=9)、高剂量组(n=10)大鼠脑缺血再灌注后3小时神经行为学评分分别为(6.000±0.926)、(4.100±0.738)、(3.444±0.726)、(2.250±0.886)(F=29.696,P0.01)；24小时神经行为学评分分别为(6.625±0.916)、(5.000±0.817)、(3.667±0.707)、(2.625±0.916)分(F=34.679,P0.01)。茶氨酸各剂量组评分均显著低于模型组(P0.05)。 2.2大鼠脑组织中茶氨酸的含量测定大鼠脑组织中茶氨酸含量随灌胃剂量的增加而升高,模型组、茶氨酸低、中、高剂量组及假手术组茶氨酸含量分别为(0.141±0.022)(0.205±0.051)(0.375±0.083)(1.064±0.133)(0.130±0.034)μmol/g(F=221.950,P0.01)。 2.3茶氨酸对脑缺血再灌注大鼠脑中单胺类神经递质含量的影响模型组、茶氨酸低、中、高剂量组及假手术组大鼠脑内DA含量分别为(10.26±1.12)、(12.48±1.09)、(14.55±0.94)、(15.97±0.92)、(11.98±0.63)μg/(F=43.755,P0.01)；5-HT含量分别为(1.091±0.160)、(0.818±0.101)、(0.571±0.050)、(0.453±0.111)、(0.863±0.063)μg/g(F=48.681,P0.01)。与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中单胺类神经递质DA含量降低,5-HT含量提高,差异有统计学意义。而茶氨酸各剂量组与模型组相比,脑组织中DA含量均提高,5-HT含量均降低,且茶氨酸高剂量组的DA含量高于低剂量组,茶氨酸高剂量组的5-HT含量低于低剂量组。 2.4脑缺血再灌注大鼠脑中GluR2mRNA、PLC-γ1mRNA的表达模型组、茶氨酸低、中、高剂量组及假手术组大鼠脑内GluR2mRNA相对表达量分别为0.842±0.020、1.063±0.100、1.170±0.152、1.254±0.131、1.012±0..056(F=9.232,P0..01)；PLC-γ1mRNA相对表达量分别为0.737±0.090、0.887±0.045、0.963±0.025、0.991±0.049、0.867±0.079(F=10.239,P0.01)。模型组大鼠脑组织GluR2mRNA的表达低于假手术组,而茶氨酸各剂量组大鼠脑组织G1uR2mRNA表达均高于模型对照组,且高剂量组还高于低剂量组,差异有统计学意义(P0.05)。茶氨酸各剂量组大鼠脑组织PLC-γ1mRNA的表达均高于模型组。其中,茶氨酸中、高剂量组还高于假手术组。 2.5脑组织中线粒体ROS生成和CAT活性测定模型组、茶氨酸低、中、高剂量组及假手术组大鼠脑线粒体活性氧生成速率分别为(3.072±0.503)、(1.331±0.268)、(1.295±0.061)、(0.804±0.200)、(2.158±0.218) U·min-1·mg·prot-1(F=80.823,P0.01)；CAT活性分别为(4.880±1.121)、(8.405±1.356)、(9.535±2.511)、(15.09±4.054)、(21.26±6.054) U/g·prot(F=28.577,P0.01)。与假手术组相比,模型组大鼠脑组织中线粒体ROS生成增加,CAT活性下降,差异有统计学意义(P0.05)。而茶氨酸各剂量组大鼠线粒体ROS生成均低于模型组及假手术组,且茶氨酸高剂量组低于中、低剂量组。茶氨酸各剂量组脑中CAT活性均高于模型组,但低于假手术组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论： 1.在本研究的色谱条件下,DA及5-HT的峰型及分离良好,脑组织样品中无其他成分干扰,保留时间适当,DA及5-HT标准曲线在0.005-1.000μg/ml的范围内线性关系良好,加标回收率较高,能用于准确测定脑组织中DA及5-HT含量。 2.茶氨酸对大鼠脑缺血再灌注引起的神经损伤具有一定保护作用,表现为茶氨酸剂量组大鼠的神经行为学障碍减轻,其机制与调节脑内单胺类神经递质DA、5-HT,上调GluR2mRNA和PLC-ylmRNA的表达,降低脑中氧化应激水平有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R151

【参考文献】