内质网应激诱导的线粒体形态功能紊乱在铅神经毒性中的作用及分子机制

发布时间：2018-04-13 13:12

本文选题：铅 + 内质网应激　；参考：《第四军医大学》2014年博士论文

【摘要】：背景铅作为重金属的一种，以各种形式广泛分布在环境中，能够通过空气、粉尘、食物、饮水等介质进入体内，并分布于人体的各个器官和组织。对人类的健康产生了严重的危害。神经系统是铅损伤机体的重要靶点，有效的控制铅暴露对神经系统的损伤，揭示铅暴露对神经系统损伤的分子机制是近年来广大科研工作者的研究重点。铅对神经系统的损伤的机制可能与以下几个方面有关：1.影响神经元的成熟、迁移和分化；2.抑制突触的生长和修复；3.抑制胶质细胞的成熟分化，导致神经系统免疫功能的紊乱；4.激活蛋白激酶C，影响神经元的能量代谢；5.抑制神经递质的释放，导致神经传递受阻；6.干扰细胞内正常蛋白质的代谢和加工，增加异常蛋白在细胞质中的错误积聚，诱导内质网应激促进神经元凋亡的发生；7.干扰细胞内的钙稳态，促使线粒体通透性的增加，导致Ca2+外流，线粒体ROS增加。铅损伤神经元的机制主要是由于神经元内各个细胞器的功能异常所导致。因此，近些年铅对亚细胞器的损伤研究成为本领域的研究热点。铅对神经元内各个细胞器的损伤各有不同，所诱导的损伤效果也存在先后关系，研究神经元铅暴露后细胞器的损伤机制可能揭示铅神经毒性的突破口，并有可能成为预防和控制铅暴露损伤的有效靶点。内质网是细胞内最大的膜性细胞器，控制着细胞内大量蛋白的加工、修饰以及合成。内质网与其它细胞器间存在着密切的联系和相互作用。研究表明，内质网与高尔基体、核内体、细胞膜、线粒体等重要的细胞器均保持着密切联系，内质网可以为其它细胞器提供各种脂质和蛋白。当细胞内出现紊乱或大量异常物质时就能够诱导内质网应激的发生。内质网应激是内质网代偿细胞内环境紊乱而发生的一种反应。研究表明，内质网应激能够促使自噬和泛素的发生，以维持细胞内环境的紊乱，但过度的内质网应激也能够引起细胞的死亡。作为细胞内重要的能量供应单位，，线粒体为了供给细胞能量的需求，它需要不断的进行动态运动，以保持其相对的稳定状态。线粒体的融合、分裂蛋白是其自身保持融合分裂平衡的关键蛋白，它们分别以跨膜的形式分布于线粒体的内膜和外膜上。它们稳定的表达是线粒体融合、分裂平衡的前提条件。线粒体与内质网之间的相互作用是近年来研究的重点，研究发现内质网与线粒体之间存在相互连接的纽带，两个细胞器通过这一纽带进行蛋白以及其它物质的交换。研究表明，铅暴露能够导致内质网应激以及线粒体片段化的发生，但两者在铅暴露过程中是否存在相互的作用、影响至今未见报道。MFN2是线粒体外膜上控制线粒体融合的重要蛋白。近年来发现MFN2也分布于内质网中，是否MFN2的合成或修饰需要内质网的参与，是否MFN2是内质网调控线粒体动态运动的关键分子，这些问题对于解决铅暴露后两个细胞器的相互作用和损伤具有重大的意义。目的通过建立铅暴露的SD大鼠动物模型、原代海马神经元铅暴露模型、PC12细胞铅暴露模型，从而揭示铅暴露对内质网应激的影响以及对线粒体形态功能紊乱的作用。运用PC12细胞铅暴露模型进一步探讨内质网应激对线粒体融合分裂紊乱的调控作用，阐明线粒体融合蛋白MFN2在内质网应激诱导线粒体融合分裂紊乱的作用和分子机制，为铅暴露对人体健康危害的防护提供理论支撑。方法 1．铅暴露模型的建立（SD大鼠、原代培养海马神经元、PC12细胞）。运用不同浓度的醋酸铅（0，100ppm，200ppm，300ppm）通过自由饮水的方式进行SD大鼠铅暴露，时间为8周；运用原子吸收分光光度计检测铅暴露后SD大鼠血铅、脑铅的变化；运用Morris水迷宫检测铅暴露对大鼠空间学习记忆能力的影响；通过Westernblot实验检测铅暴露SD大鼠海马脑区中神经元的程序性死亡。运用Neuron Basal以及DMEM培养基配置不同浓度的醋酸铅（0，1μM，2.5μM，5μM，10μM）刺激原代海马神经元以及PC12细胞。采用MTT检测实验、LDH检测实验、流式细胞仪检测铅暴露对原代海马神经元以及PC12细胞活力、细胞损伤以及细胞凋亡的影响。 2．铅暴露对内质网应激的影响。通过Western blot实验检测SD大鼠、原代海马神经元、PC12细胞铅暴露后内质网应激相关蛋白的改变；运用高分辨的电子显微镜观察SD大鼠、以及PC12细胞铅暴露后内质网的形态改变； 3．铅暴露对线粒体形态和功能的影响。运用高分辨的电子显微镜、激光共聚焦显微镜观察SD大鼠、原代海马神经元以及PC12细胞铅暴露后线粒体形态的改变；通过Western blot实验、RT-PCR实验检测SD大鼠、原代海马神经元、PC12细胞铅暴露后线粒体融合蛋白的改变；运用DCFH-DA探针法检测原代海马神经元以及PC12细胞铅暴露后ROS的改变。 4．铅暴露后内质网应激对线粒体形态和功能的影响。运用激光共聚焦显微镜、高分辨的电子显微镜观察铅暴露后线粒体和内质网的相互作用；运用内质网应激的抑制剂4-PBA预处理铅暴露的PC12细胞，通过Western blot实验检测内质网应激蛋白、线粒体融合蛋白的改变；DCFH-DA探针法检测ROS的改变；MTT检测实验、LDH检测实验、流式细胞仪检测分别观察细胞活力、细胞损伤以及细胞凋亡的影响。 5．线粒体融合蛋白MFN2降低与内质网应激在铅细胞毒性中的作用和分子机制。建立线粒体融合蛋白MFN2过（低）表达的PC12细胞，运用MTT检测实验、LDH检测实验观察细胞活力和细胞损伤的改变；通过Western blot实验、免疫细胞荧光检测铅暴露对自噬降解和泛素降解途径的影响；通过免疫共沉淀、免疫细胞荧光检测自噬相关蛋白LC3、泛素E3连接酶PINK1分别与MFN2的共表达，揭示MFN2降低的机制；通过干预PINK1的表达，运用Western blot实验、免疫细胞荧光以及DCFH-DA探针法检测PINK1低表达后铅暴露对线粒体形态和功能的影响。结果 1.铅暴露的神经毒性。 1) SD大鼠铅暴露模型的建立。运用Morris水迷宫检测铅暴露8周后SD大鼠空间学习记忆能力发现铅暴露能够导致大鼠的空间记忆能力降低；Western blot检测海马脑区神经元的凋亡、自噬相关蛋白表达发现铅暴露能够诱导大鼠海马脑区Caspase3的剪切以及Beclin1、LC3II的表达； 2)原代海马神经元和PC12细胞铅暴露模型的建立。MTT检测细胞活力发现铅暴露能够抑制原代海马神经元和PC12细胞的活力和增殖；LDH检测实验发现铅暴露能够促进原代海马神经元和PC12细胞的LDH释放； 2.铅暴露对内质网应激的影响。 1)铅暴露对内质网应激相关蛋白的影响。Western blot检测铅暴露后内质网应激蛋白的表达发现铅暴露能够促进大鼠海马脑区神经元、原代海马神经元、PC12细胞内质网相关蛋白Grp78的表达以及分子PERK/CHOP的活化； 2)铅暴露对内质网形态的改变。透射电镜检测发现铅暴露能够引起大鼠海马脑区神经元和PC12细胞内质网管腔的扩张和肿胀。 3.铅暴露对线粒体形态功能的影响。 1)铅暴露能够诱导线粒体形态的改变。透射电镜检测发现发现铅暴露能够导致大鼠海马脑区神经元、PC12细胞线粒体形态改变，表现为：线粒体发生肿胀和空泡化；Mito-tracker染色后发现铅暴露能够引起PC12细胞线粒体平均长度降低； 2)铅暴露对线粒体融合蛋白的影响。Western blot实验发现铅暴露能够引起大鼠海马脑区神经元、原代海马神经元以及PC12细胞内线粒体融合蛋白MFN2、MFN1蛋白水平降低；RT-PCR实验发现铅暴露能够引起大鼠海马神经元、原代海马神经元以及PC12细胞内线粒体融合蛋白MFN1的mRNA降低； 3)铅暴露对ROS的促进作用。DCFH-DA探针法检测发现铅暴露能够诱导ROS水平增加。 4. PC12细胞内质网与线粒体的交互作用在铅毒性中的作用。 1)铅暴露能够诱导内质网线粒之间相互作用。Mito-tracker、ER-tracker染色发现铅暴露能够增加线粒体与内质网的接触面积；免疫电镜检测发现铅暴露能够引起线粒体与内质网之间的距离变短，降低线粒体融合蛋白MFN2在线粒体外膜上的表达，增加MFN2在内质网管腔中的表达； 2)内质网应激在铅暴露诱导线粒体形态功能异常中的重要作用。Western blot实验发现运用内质网应激的抑制剂4-PBA能够抑制内质网应激蛋白的表达，并能够有效抑制铅暴露诱导的线粒体融合蛋白MFN2、MFN1蛋白表达的降低；RT-PCR检测实验发现内质网应激的抑制剂4-PBA能够抑制铅暴露诱导的线粒体融合蛋白MFN1的mRNA降低；Mito-tracker染色实验发现内质网应激的抑制剂4-PBA能够抑制铅暴露诱导的线粒体长度降低； 3)内质网应激在铅暴露诱导细胞损伤中的重要作用。MTT检测实验发现4-PBA能够抑制铅暴露诱导的PC12细胞活力降低；流式细胞仪检测发现4-PBA能够抑制铅暴露诱导的PC12细胞凋亡。 5.线粒体融合蛋白MFN2降低与内质网应激在铅细胞毒性中的作用和分子机制。 1) MFN2在铅神经毒性中的关键作用。MTT、LDH检测发现线粒体融合蛋白MFN2水平与铅毒性呈负相关； 2) MFN2降低与自噬降解系统之间的关系。Western blot检测实验发现铅暴能够诱导PC12细胞自噬相关蛋白Beclin1的表达；免疫细胞染色实验发现铅暴露能够诱导自噬相关蛋白Beclin1、LC3蛋白的表达，但自噬相关蛋白LC3与MFN2的共定位现象并未发现； 3) MFN2降低与泛素降解系统之间的关系。Western blot实验发现铅暴露能够引起总泛素水平以及泛素E3连接酶PINK1的表达；免疫共沉淀实验发现铅暴露能够促进MFN2与泛素E3连接酶PINK1的相互作用；Western blot检测实验发现4-PBA能够抑制铅暴露诱导的泛素水平以及泛素E3连接酶PINK1的高表达； 4) E3连接酶PINK1在MFN2泛素降解中的关键作用。Western blot实验以及免疫细胞染色实验发现干涉PINK1后能够回转铅暴露诱导的MFN2蛋白表达降低；Mito-tracker染色以及DCFH-DA探针法检测发现干涉PINK1后能够回转铅暴露诱导的线粒体形态以及功能的紊乱。结论铅暴露能够引起细胞内质网形态改变以及应激的发生，进一步促使泛素E3连接酶PINK1的表达增加，增强PINK1与线粒体外膜上MFN2的结合和泛素降解，最终导致线粒体形态功能的紊乱。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R135.11

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