鱼类主要过敏原小清蛋白的单克隆抗体制备及其金磁酶联免疫体系的构建

发布时间：2018-04-19 01:17

  本文选题：小清蛋白 + 间接ELISA　； 参考：《上海师范大学》2017年硕士论文

【摘要】：鱼类及其制品含有丰富的营养,同时也是FAO及WHO认定的导致人类过敏的八大类食物之一。其中鱼肉中的小清蛋白(parvalbumin,PV)被视为主要的过敏原,因此开展针对鱼类及其制品中小清蛋白强特异性、高灵敏度的检测具有重要的理论和现实意义。本文研究主要包括小清蛋白单克隆抗体的制备及鉴定、金磁复合纳米微粒与酶标抗原的制备以及小清蛋白金磁酶联免疫检测方法的建立。具体研究内容如下:鱼类主要过敏原小清蛋白的制备使用硫酸铵分级沉淀法,从新鲜的鲫鱼鱼肉中提取、纯化过敏原小清蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳表征过敏原小清蛋白的纯度,最后冻干样品后保存于-20℃冰箱备用。2、小清蛋白单克隆抗体的制备以高纯度的PV免疫4只BALB/c小鼠,利用间接ELISA方法测小鼠抗血清效价,获取效价最高的小鼠(PV效价为1:256000)。取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,获得杂交瘤细胞。间接ELISA方法筛选阳性孔,有限稀释法进行3次亚克隆得到分泌同质的杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生腹水法大量制备单抗。3、小清蛋白单克隆抗体的鉴定采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单抗腹水,SDS-PAGE凝胶电泳表征单克隆抗体纯度,并采用Western-blotting、考马斯亮蓝染色法分别检测单抗特异性及抗体浓度,结果显示PV单克隆抗体具备良好的特异性,并且单抗浓度为300ug/mL,最后通过商业化试剂盒检测PV单抗亚类为IgG1型。4、金磁(Fe_3O_4/Au)复合微粒与酶标抗原的制备采用一锅法制备氨基化的磁性微粒Fe_3O_4-PEI,之后在其表面包覆两层Au颗粒,制备金磁(Fe_3O_4/Au)复合微粒,金磁复合微粒形貌呈圆形,粒径均一,粒径约150nm。采用过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶(HRP)标记PV,用于后面金磁酶联免疫体系的建立。5、金磁酶联免疫法检测过敏原小清蛋白体系的建立按照最佳条件制备得到金磁免疫探针和PV酶标抗原后,将它们与PV标准溶液竞争结合建立金磁酶联免疫检测体系,初步探究了该体系在鱼类及其制品中检测小清蛋白的可行性。研究结果显示PV浓度5.5-289ng/ml范围内,PV浓度对数与抑制率有良好的线性关系,标准曲线为y=34.96x-6.0357,R~2=0.9979;IC_(50)为40.1ng/mL,LOD为2.8ng/mL。此外,对该检测体系进行方法学评价,包括精密度、特异性、稳定性。结果显示该方法对PV检测的批内变异系数在4.3%-9.6%之间,批间变异系数在5.5%-11.7%之间;该方法与食品中其他主要过敏原蛋白交叉反应率都小于1%,具有良好的特异性,并且金磁探针的稳定性在15天左右。此金磁酶联免疫法可以提高检测的灵敏度和特异性,在食品安全检测中有重要的实际应用价值。
[Abstract]:Fish and its products are rich in nutrition and one of the eight kinds of food identified by FAO and WHO as causing human allergies.The protein parvalbumin (PVV) in fish is regarded as the main allergen, so it is of great theoretical and practical significance to develop a highly specific and sensitive detection method for small and medium albumin in fish and its products.In this paper, the preparation and identification of monoclonal antibody against white white protein, the preparation of gold magnetic composite nanoparticles and enzyme labeled antigen, and the establishment of gold magnetic enzyme linked immunosorbent assay for white white protein were studied.The main contents of the study were as follows: the preparation of the main allergen microalbumen in fish was extracted from fresh crucian carp meat by ammonium sulfate precipitation method and purified. The purity of the protein was characterized by SDS-PAGE gel electrophoresis.Finally, freeze-dried samples were stored in -20 鈩，

本文编号：1770945