Ac-SDKP抑制矽肺上皮-间质转化及其机制

发布时间：2018-05-04 17:14

本文选题：N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸 + 热休克蛋白27　；参考：《河北医科大学》2014年博士论文

【摘要】：目的：矽肺是一种职业性疾病。在我国，由于经济的较快发展，促进了工业化进程的加快。而尘肺病的发病率也在逐年升高。近年来尘肺病的发病人数以每年超过2万例的速度增长。截至2012年底，全国累计报告职业病人数为807269例，其中，尘肺病为727148例，占到职业病总人数的90%。在这些患者中一半以上为矽肺病。因此，在我国矽肺是最多见、最严重的尘肺病。矽尘作为潜在的致纤维化因子，能促进支气管/肺泡上皮细胞凋亡，并可介导支气/肺泡上皮细胞向肌成纤维细胞的转化，即上皮-间质转变。目前认为上皮-间质转变是矽肺病发生发展的一个重要环节。我们前期应用蛋白质组学技术在矽肺大鼠肺组织中筛选出33个有意义的差异性蛋白，其中热休克蛋白27是比较典型的差异蛋白之一。HSP27作为一个小分子量热休克蛋白，在上皮间质转变过程中，可通过调节核转录因子SNAI1的表达而参与上皮-间质转变的过程。 N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline, Ac-SDKP）是一种具有抗器官纤维化功能的短肽，我们和其他课题组发现Ac-SDKP具有抑制器官纤维化（包括心、肾、肺）的功能。近期我们报道了Ac-SDKP能够通过抑制TGF-β及其受体诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，进而抑制矽肺纤维化的发生、发展，而发挥其拮抗矽肺纤维化的作用。然而，Ac-SDKP能够能够通过调节上皮-间质的转变调控矽肺纤维化的发生与发展？尚无文献报道。本研究拟采用体内矽肺动物模型结合体外细胞培养及其体外细胞转染等方法，研究与探讨Ac-SDKP能否通过对HSP27表达的调节，调控支气管/肺泡上皮细胞向肌成纤维细胞的转化，进而阻抑矽肺纤维化的形成与进展。进一步揭示Ac-SDKP抗矽肺纤维化作用的分子机制，为将其开发为一种抗矽肺纤维化的新药提供一些重要的理论与实验依据，并对其它器官（肝、肾、心血管）纤维化疾病的防治研究提供一些重要的信息。方法：采用支气管一次性灌注二氧化硅（SiO2）粉尘制作大鼠矽肺模型，动物被分为：1）对照4周组；2）矽肺4周组；3）Ac-SDKP单独给药4周组；4）对照8周组；5）矽肺8周组；6）Ac-SDKP单独给药8周组；7）Ac-SDKP后处理组（抗纤维化治疗组）；6）Ac-SDKP前处理组（预防治疗组）。体外培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞，并分为：1）对照组；2）TGF-β1诱导组；3）Ac-SDKP干预组（TGF-β1+Ac-SDKP）；4）Ac-SDKP单独给药组。采用免疫组织化学染色、免疫细胞化学染色、Western blot或Realtime PCR等方法检测HSP27、磷酸化HSP27、SNAI1、SNAI2、上皮组织标记物CK、SP-A、间质组织标记物α-SMA、vimentin、I型和III型胶原蛋白的表达。采用激光共聚焦显微镜检测矽肺模型大鼠SP-A与α-SMA、pHSP27与α-SMA的共定位表达；检测人肺泡Ⅱ型上皮细胞各组别HSP27与SNAI1、HSP27与SNAI2的共定位表达。采用体外细胞转染的方法将特异性HSP27基因片段转染人肺泡Ⅱ型上皮细胞，实验分为7组，1)空质粒对照组；2）空质粒+TGF-β1组；3）HSP27干扰质粒+TGF-β1组；4）空质粒+TGF-β1+Ac-SDKP组；采用Western blot方法检测E-cad、α-SMA、HSP27、磷酸化HSP27、SNAI1、SNAI2、I型III型胶原蛋白的表达。结果： 1Ac-SDKP对矽肺大鼠肺组织中间质组织标志蛋白（α-SMA、Vimentin）和上皮组织标志蛋白（E-cad、SP-A）表达的调节作用免疫组织化学染色结果显示，在正常对照组α-SMA、Vimentin仅在大鼠血管和气管平滑肌细胞中阳性表达，而在矽肺大鼠间质纤维化区域和矽结节中可见较多的α-SMA和Vimentin阳性表达的细胞。而Ac-SDKP治疗给药组（包括前处理与后处理组）α-SMA和Vimentin阳性表达的细胞数量和范围均明显减少。激光共聚焦扫描显微镜结果显示，正常对照组可见红色荧光标记的SP-A表达阳性细胞，体积较大，呈扁平或立方状，多贴覆在肺泡壁的腔面。肺泡壁内可见少量绿色荧光标记的α-SMA表达阳性的细胞。在矽肺模型组，可见矽结节内有大量绿色荧光标记的α-SMA表达阳性的细胞，其间夹杂有一定数量的红色荧光标记的SP-A表达阳性细胞。采用两种蛋白荧光组合定位技术，可见一些紫粉色标记的细胞存在于矽结节内，多分布在结节的边缘区域，少量分布于结节内部。表明，在矽结节中有肺泡II型上皮细胞的存在与增生，而部分肺泡II型上皮胞浆中有α-SMA阳性蛋白的表达。而Ac-SDKP治疗组（包括预防治疗和抗纤维化治疗）α-SMA阳性表达的细胞数量较矽肺模型组减少，SP-A表达阳性细胞较矽肺模型组多。 Western blot结果显示，与正常对照组相比，矽尘模型4周组α-SMA和Vimentin表达分别是对照组4周组的1.6倍和3.7倍，矽尘模型8周组α-SMA和Vimentin的表达分别是对照8周组的1.6倍和2.9倍。Ac-SDKP单独给药组和正常对照组相比，差异无统计学意义（P0.05）。经Ac-SDKP干预后，Ac-SDKP治疗组和预防组中α-SMA表达分别是矽尘模型8周组的69%和67%，Vimentin的表达分别是矽尘模型8周组的59%和55%。而E-cad在矽肺模型4周组和8周组分别是正常对照4周组和8周组的49%和35%，SP-A的表达分别是正常对照组的50%和21%。经Ac-SDKP干预后，Ac-SDKP治疗组和预防组中E-cad的表达分别是矽尘模型8周组的2.3倍和2.6倍，SP-A的表达分别是矽尘模型8周组的4.5倍和4.4倍。 2Ac-SDKP对矽肺大鼠肺组织中HSP27、pHSP27和SNAI1、SNAI2以及I型、III型胶原蛋白表达的调节作用免疫组织化学染色结果显示，在正常对照组HSP27、pHSP27、SNAI1在大鼠血管和气管平滑肌细胞中有少量阳性表达，而在矽肺大鼠间质纤维化区域和矽结节中可见较多的HSP27、pHSP27、SNAI1阳性表达的细胞。激光共聚焦扫描显微镜观察显示，红色荧光标记的pHSP27（HSP27蛋白的活性形式）在气管平滑肌管壁和肺泡壁内呈弱阳性表达。而矽肺模型组的矽结节中有较多pHSP27蛋白呈强阳性表达，pHSP27蛋白多表达于结节内细胞的胞浆中。而矽结节内也可见大量绿色荧光标记的α-SMA。采用荧光重合叠加技术显示，矽结节内部分细胞呈紫粉色，即pHSP27蛋白（红色荧光）和α-SMA蛋白（绿色荧光）重合叠加的结果。 Western blot结果显示，矽肺模型组中HSP27和pHSP27蛋白的表达均上调。其中矽肺模型组4周和8周组HSP27蛋白的表达分别是对照4周和8周组的1.5倍和2.1倍，pHSP27的表达分别是对照组的2.1倍和2.1倍。Ac-SDKP单独给药组和正常对照组相比，差异无统计学意义（P0.05）。Ac-SDKP干预处理后，能够明显下调HSP27和pHSP27蛋白的表达。其中Ac-SDKP治疗组和预防组中HSP27蛋白表达分别是矽肺模型8周组的75%和65%，pHSP27蛋白表达分别是矽肺模型8周组的72%和68%。同时矽肺模型组中SNAI1、SNAI2蛋白的表达均上调。其中矽肺模型组4周和8周组SNAI1蛋白的表达分别是对照4周和8周组的3.1倍和2.7倍，SNAI2蛋白的表达分别是对照组的1.8倍和1.5倍。Ac-SDKP单独给药组和正常对照组相比，差异无统计学意义（P0.05）。Ac-SDKP干预处理后，Ac-SDKP治疗组和预防组中SNAI1蛋白的表达分别是矽肺模型8周组的62%和54%， SNAI2蛋白的表达分别是矽肺模型8周组79%和75%。此外，在矽肺模型组中I型胶原和III型胶原的表达均明显上调。其中矽肺模型4周和8周组中I型胶原表达分别是对照4周和8周组的1.7倍和1.6倍，III型胶原表达分别是对照组的1.6倍和1.8倍。Ac-SDKP单独给药组和正常对照组相比，差异无统计学意义（P0.05）。Ac-SDKP干预处理后I型胶原和III型胶原蛋白的表达均明显下调，其中Ac-SDKP治疗组和预防组中I型胶原蛋白的表达分别是矽肺模型8周组的78%和73%，III型胶原蛋白的表达分别是矽肺模型8周组的74%和73%。 3Ac-SDKP对TGF-β1诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞的上皮标志蛋白E-cad、CK和间质标志蛋白α-SMA、Vimentin表达的调节作用免疫细胞化学染色结果显示，正常对照组中CK在人肺泡II型上皮细胞中呈阳性表达，而α-SMA、Vimentin在正常对照组的人肺泡II型上皮细胞中呈阴性表达（或仅在细胞浆中有微量黄色着色），而在TGF-β1诱导72小时后，上皮细胞胞体由原来的类圆形向呈长梭形改变，胞浆丰富，胞核变圆变大，α-SMA、Vimentin在胞浆中表达增强，棕黄色着色明显，而CK在TGF-β1诱导72小时后，在细胞中的表达却不甚明显；当Ac-SDKP干预处理后，α-SMA、Vimentin的染色强度TGF-β1诱导组较明显减弱，细胞仍呈类圆形（无明显长梭形形态的变化），而CK的表达较TGF-β1诱导组确有所增强。Ac-SDKP单独给药组和正常对照组相比在细胞形态和染色强度上没有明显区别。 Western blot和Real-time PCR结果显示，TGF-β1诱导人肺泡Ⅱ型上皮细胞24、48、72小时，均能够显著降低上皮标志蛋白E-cad、CK蛋白的表达，同时增加了间质标志蛋白α-SMA、 Vimentin的表达。其中，与对照组比较，TGF-β1诱导24、48、72小时，E-cad蛋白表达均下调到50%，CK蛋白均下调到40%；而在TGF-β1诱导72小时，E-cad mRNA表达下调到26%。与对照组比较，TGF-β1诱导24、48、72小时，α-SMA蛋白表达分别上调了1.9倍、2.5倍和1.8倍，Vimentin蛋白表达分别上调了1.6倍、2.3倍和1.9倍。给予Ac-SDKP干预处理后，均能增加TGF-β1诱导的人肺上皮细胞E-cad、CK的表达。其中干预作用24、48、72小时，E-cad蛋白表达分别为TGF-β1诱导组的1.8倍、1.8倍和2.0倍和CK蛋白表达分别为TGF-β1诱导组的2.4倍、2.3倍和2.6倍。而Ac-SDKP干预作用72小时，与TGF-β1诱导组相比较，E-cad mRNA的表达上调了3.4倍。而给予Ac-SDKP干预处理后，能够降低间质标志蛋白α-SMA、Vimentin的表达。其中干预作用24、48、72小时，α-SMA蛋白表达分别为TGF-β1诱导组的63%、72%、66%，Vimentin蛋白的表达分别是TGF-β1诱导组的69%、54%和68%。Ac-SDKP单独给药组和正常对照组相比蛋白水平和E-cad mRNA表达水平在各个时间点均无显著性差异（P0.05）。 4Ac-SDKP对TGF-β1诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞HSP27、pHSP27和SNAI1、SNAI2以及I型和III型胶原蛋白表达的调节作用免疫细胞化学染色结果显示，正常对照组中HSP27、pHSP27、SNAI1在人肺泡II型上皮细胞中呈阴性表达(或在细胞浆和核中有微量黄色着色)，而在TGF-β1诱导72小时后，伴随着细胞胞体呈长梭形改变、胞浆丰富、胞核变圆变大，可见HSP27、pHSP27和SNAI1蛋白分别在胞浆和胞核中的着色加深。而Ac-SDKP干预处理后，HSP27、pHSP27、SNAI1的染色强度较TGF-β1诱导组明显减弱，细胞仍呈类圆形。Ac-SDKP单独给药组和正常对照组相比在细胞形态和染色强度上没有明显区别。激光共聚焦扫描显微镜结果显示，经TGF-β1诱导刺激后，细胞呈长梭形改变，胞浆内HSP27蛋白绿色荧光强度明显加强，胞核内SNAI1蛋白表达红色荧光强度增强，而SNAI2蛋白在胞核与胞浆内均有红色荧光表达；给予Ac-SDKP干预后，细胞向长梭形改变不明显，胞浆内HSP27蛋白绿色荧光强度明显减弱，胞核内SNAI1蛋白与胞浆和胞核内SNAI2红色荧光强度亦随之减弱。经TGF-β1诱导刺激后，随着细胞呈长梭形改变，F-actin在胞浆内呈绿色肌丝样结构表达；给予Ac-SDKP干预后细胞长梭形改变不明显，但F-actin绿色肌丝样结构表达较少。 Western blot和Real-time PCR结果显示，与对照组比较，TGF-β1诱导的24、48、72小时，均能够显著上调人肺泡II型上皮细胞HSP27、pHSP27的表达。其中，TGF-β1诱导的24、48、72小时，HSP27蛋白表达分别是对照组的1.5倍、1.9倍和1.9倍，pHSP27蛋白表达分别是对照组的1.7倍、2.5倍和3.0倍。TGF-β1诱导72小时，HSP27mRNA表达是对照组的1.9倍。而在TGF-β1诱导后，人肺泡II型上皮细胞的核转录因子SNAI1和SNAI2的表达均上调，其中TGF-β1诱导的24、48、72小时，SNAI1的蛋白表达分别是对照组的2.3倍、2.2倍和1.3倍，SNAI2蛋白的表达分别是对照组的1.5倍、1.7倍和1.9倍。TGF-β1诱导72小时，SNAI1和SNAI2mRNA表达分别是对照组的3.1倍和2.3倍。同时，TGF-β1诱导24、48、72小时，伴随人肺泡II型上皮细胞I型和III型胶原蛋白表达的增加，其中，I型胶原蛋白表达分别是对照组的1.5倍、2.1倍和2.2倍，III型胶原蛋白表达分别是对照组的1.5倍、1.9倍和2.5倍。 Ac-SDKP干预处理后，上述蛋白的表达均下调。干预作用24、48、72小时，HSP27蛋白表达分别是TGF-β1诱导组的71%、62%和74%，pHSP27蛋白表达分别是TGF-β1诱导组的56%、44%、44%。干预作用72小时，HSP27mRNA表达是TGF-β1诱导组的64%。Ac-SDKP干预处理后，核转录因子SNAI1和SNAI2的表达同时也被下调。其中，干预作用24、48、72小时，SNAI1蛋白的表达分别是TGF-β1诱导组的50%、71%和75%，SNAI2蛋白的表达分别是TGF-β1诱导组65%、64%、66%。干预作用72小时，SNAI1和SNAI2mRNA表达分别是TGF-β1诱导组的38%和77%。Ac-SDKP干预处理后，同时伴有I型和III型胶原蛋白表达的下降。其中，干预作用24、48、72小时，I型胶原蛋白表达分别是TGF-β1诱导组的62%、43%和66%，III型胶原蛋白表达分别是TGF-β1诱导组的66%、52%和44%。Ac-SDKP单独给药组和正常对照组相比，各个因子蛋白和mRNA的表达在各个时间点均无显著性差异（P0.05）。 5Ac-SDKP对体外转染HSP27干扰质粒的人肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞转化的作用机制体外用脂质体转染细胞的方法把HSP27的干扰质粒转染人肺泡Ⅱ型上皮细胞，经TGF-β1诱导48小时。Western blot结果显示，经TGF-β1刺激的HSP27的干扰质粒组与TGF-β1刺激的空质粒组比较，SNAI1和α-SMA的表达下调，E-cad表达上调，同时伴有I型和III型胶原蛋白表达下调，差异具有统计学意义（P 0.05），，而SNAI2蛋白的表达差异不具有统计学意义（P＞0.05）。Ac-SDKP干预处理空质粒组与经TGF-β1刺激的空质粒组相比α-SMA、SNAI1、SNAI2表达下调，E-cad表达上调，I型和III型胶原蛋白表达下调，差异具有统计学意义（P 0.05），其结果与HSP27的干扰质粒转染人肺泡Ⅱ型上皮细胞后的干预效果相似。结论： 1矽肺纤维化发生时，存在（支气管/肺泡）上皮细胞向肌成纤维细胞转化的病变过程。 2在矽肺大鼠模型中，Ac-SDKP能够通过抑制（支气管/肺泡）上皮细胞向肌成纤维细胞的转化，进而抑制胶原的合成与沉积，发挥抗矽肺纤维化的作用。这一调控作用可能与调节HSP27蛋白的表达密切相关。 3体外细胞培养和HSP27的干扰质粒转染实验证实，Ac-SDKP能够通过下调HSP27的表达，抑制核转录因子SNAI1和α-SMA的表达，上调E-cad的表达，进而抑制I型与III型胶原的表达。Ac-SDKP能够通过抑制上皮细胞向肌成纤维细胞分化而发挥其抗矽肺纤维化的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R135.2

【引证文献】