几种香辛料提取物对常见食源性致病菌生物膜作用的研究

发布时间：2018-05-09 19:59

  本文选题：食源性致病菌 + 生物膜　； 参考：《华南农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是常见的食源性致病菌,都能影响食品的质量安全,对人体健康造成威胁,严重的可引起死亡。生物膜(biofilm)是由微生物形成的被其自身分泌的胞外基质所包裹的一类群体,这种特殊的结构能够抵御多种抗生素及抗菌剂的作用,从而有助于微生物自身的生存。但在医疗与食品安全领域,这种机制则可能引起严重的感染风险。而传统的用抗生素、消毒剂等处理的策略,不仅效果有限而且容易使细菌产生耐药性。因此开发出安全、高效、天然的抗生物膜的物质则具有非常重要的意义。本研究采用水提法和醇提法对10种天然香辛料(花椒、胡椒、丁香、肉桂、迷迭香、辣木叶、辣木茎、大蒜、洋葱、小茴香)的抑菌物质进行提取,在研究其抑菌能力的基础上筛选出抑菌能力强的提取物,进一步通过结晶紫染色法、微量二倍肉汤稀释法、XTT减低法、苯酚硫酸法以及激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)等方法来探究香辛料提取物对三种致病菌生物膜的抑制和清除作用。研究内容及结果如下:1.针对10种香辛料的提取物,用牛津杯法测定其对三种致病菌的抑菌作用。结果表明:不同的香辛料对不同的菌种有不同的抑制效果,大蒜、肉桂、辣木叶、辣木茎、丁香等都表现出很强的抗菌作用,而花椒、胡椒、小茴香、迷迭香等则相对较弱,洋葱的乙醇提取物和水提取物都没有表现出抑菌作用。总体上乙醇提取物的抑菌效果要强于水提取物,副溶血弧菌对香辛料的敏感性强于金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌。2.根据抑菌圈的大小,针对每种致病菌选取两种抑菌效果最好的提取物并对其进行了复配,然后进行最小抑菌浓度(MIC)的测定。结果表明:所有的提取物对各自对应菌的MIC都在6.25mg/mL与12.5 mg/mL之间;相同的提取物对不同的菌种,其MIC也有所不同,如大蒜对金黄色葡萄球菌的MIC为12.5 mg/mL,而对副溶血弧菌的MIC则为6.25 mg/mL,说明金黄色葡萄球菌对大蒜的耐受性要强于副溶血弧菌;同时在复配实验中,我们发现,所有的复配物的抑菌能力并没有比单一提取物的强。3.通过结晶紫染色法研究pH、温度、时间以及营养水平等因素对生物膜形成的影响。结果表明:三种致病菌在一定的pH范围,只要不是过酸或过碱的环境,都能形成生物膜,但相对来说它们都更适于偏碱性的环境;而温度对生物膜形成的影响则更显著,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最适温度为37℃,副溶血弧菌的最适温度为30℃;时间对生物膜形成的影响也比较显著,而且三种致病菌的生物膜都在48h后达到成熟;富营养水平能够显著增加生物膜的形成量。4.根据筛选得到的香辛料提取物,分别研究其对三种致病菌生物膜形成的影响。结果发现:亚抑菌浓度的提取物都能够对生物膜的形成产生抑制作用,而且其还能抑制生物膜内细菌的代谢活性,减少细菌胞外多糖的分泌。CLSM观察发现,处理后死细胞的数量明显增多,且生物膜的厚度明显变小。5.进一步研究高抑菌浓度的提取物对成熟生物膜的清除能力。结果表明:高浓度的提取物对成熟的生物膜起到一定的清除作用,且能进入生物膜的内部杀死细菌,同时减少胞外多糖的附着,通过CLSM也观察到同样的现象。综上所述,本研究的香辛料具有一定的抑菌能力,且能够对生物膜产生抑制及清除作用,具有重要的开发潜力及应用价值。
[Abstract]:Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), Escherichia coli (Escherichia coli) and Vibrio parahaemolyticus (Vibrio parahaemolyticus) are common foodborne pathogens, which can affect the quality and safety of food, pose a threat to human health and cause serious death. The biofilm (biofilm) is produced by microbes and is secreted by its own. A group of groups encapsulated in the extracellular matrix that can resist the effects of a variety of antibiotics and antimicrobials to help the survival of the microbes themselves. But in the field of medical and food safety, this mechanism may cause serious infection risk. The traditional strategies for treating the antibiotic and disinfectants are not only effective. It is very important to develop a safe, efficient and natural antibiofilm substance. This study uses water extraction and alcohol extraction to extract 10 natural spices (pepper, pepper, lilac, cinnamon, rosemary, spicy wood, horseradish, garlic, onion, fennel) On the basis of the study of its bacteriostasis ability, the extracts of strong bacteriostasis were screened, and the inhibitory and scavenging effects of spice extracts on the three kinds of pathogenic biofilms were further studied by means of crystal violet staining, micro two times broth dilution, XTT reduction, phenol sulfuric acid and laser confocal scanning microscope (CLSM). The contents and results are as follows: 1. according to the extract of 10 kinds of spices, the bacteriostasis effect of the three kinds of pathogens was determined by Oxford cup. The results showed that different spices had different inhibitory effects on different strains. Garlic, cinnamon, spicy wood leaves, horseradish stems, clove, etc. all showed strong antibacterial effect, and pepper, pepper, fennel, fan. The ethanol extract and water extract of onions did not exhibit bacteriostasis. On the whole, the inhibitory effect of ethanol extract was stronger than that of water extract. The sensitivity of Vibrio parahaemolyticus to spices was stronger than that of Staphylococcus aureus and Vibrio parahaemolyticus.2. according to the size of bacteriostasis, and two of each pathogen was selected. The extracts of the best bacteriostasis were combined, and then the minimum inhibitory concentration (MIC) was measured. The results showed that all the extracts of all the extracts against the corresponding bacteria were between 6.25mg/mL and 12.5 mg/mL; the same extracts were different for different strains, and the MIC was 12.5, for example, the MIC of Staphylococcus aureus was 12.5. Mg/mL, and the MIC of Vibrio parahaemolyticus was 6.25 mg/mL, indicating that the tolerance of Staphylococcus aureus to garlic was stronger than Vibrio parahaemolyticus. At the same time, we found that the Bacteriostasis of all the compounds was not better than the strong.3. of the single extract to study pH, temperature, time and nutrition level by the crystal violet staining method. The effect of factors on the formation of biofilm shows that the three pathogenic bacteria can form a biofilm in a certain range of pH, as long as it is not overacid or overalkali, but they are more suitable for alkaline environment, while temperature has a more significant effect on the formation of biofilm, and the optimum temperature for Staphylococcus aureus and Escherichia coli is 37. The optimum temperature of Vibrio parahaemolyticus was 30 degrees C, and the effect of time on the formation of biofilm was also significant, and the biofilm of the three pathogenic bacteria reached maturity after 48h, and the eutrophic level could significantly increase the formation of biofilm,.4. based on the screened spice extract, and study the formation of the biofilms of three pathogenic bacteria respectively. The results showed that the extract of subinhibitory concentration could inhibit the formation of biofilm, and it could inhibit the metabolic activity of bacteria in the biofilm and reduce the secretion of extracellular polysaccharide by.CLSM observation. The number of dead cells after treatment was significantly increased, and the thickness of the biofilm was obviously reduced by.5. to further study the high inhibition. The results of the scavenging ability of the extract on the mature biofilm show that the high concentration extracts have a certain scavenging effect on the mature biofilm, and can enter the biofilm to kill the bacteria, and reduce the attachment of the extracellular polysaccharide, and also observe the same phenomenon through CLSM. In the summary, the spices of this study are certain. Its bacteriostatic ability and its ability to inhibit and remove biofilms have important development potential and application value.

【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R155.3

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