左卡尼汀对过氧化氢损伤人HL7702肝细胞的保护作用研究
发布时间：2018-05-13 20:18
本文选题：左卡尼汀 + HL7702细胞 ； 参考：《青岛大学》2016年博士论文
【摘要】：目的:左卡尼汀(L-carnitine,LC)又称左旋肉碱,是人体必需的一种类维生素营养素,在动物性食品中含量丰富。临床研究发现,肝病病人体内LC缺乏,外源性补充LC对多种肝病具有辅助治疗作用。实验研究也证实,LC对多种因素诱导的肝损伤具有保护作用。目前,LC保肝作用分子机制尚未阐明,本课题将建立过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)诱导的人HL7702肝细胞损伤模型,从抗氧化、细胞信号转导分子(Nrf_2、MAPK、PI3K/Akt、PPAR-α、AMPK、GSK-3β)的角度探究LC保护肝细胞损伤的分子机制。方法:1.LC对H_2O_2损伤HL7702肝细胞活性及抗氧化能力的影响:实验设计为:正常对照组、H_2O_2损伤组、LC组(0.1、0.5、1.0 mmol/L)。分别以MTT、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)法检测细胞活性;酶化学法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性及丙二醛(MDA)含量;以2,7-二氯氢化荧光素二酯(DCFH-DA)为荧光探针,流式细胞术测定细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。2.LC对核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf_2)/血红素加氧酶1(heme oxygenase,HO-1)通路的调控:Western blot技术检测Nrf_2、HO-1蛋白的经时表达;免疫荧光染色法确定Nrf_2的核转位;凝胶迁移实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)评价Nrf_2-DNA结合活性;Nrf_2 si RNA技术分析Nrf_2与HO-1的级联关系及Nrf_2在LC保护肝细胞损伤中的作用。3.LC对丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路的调控:Western blot测定H_2O_2损伤HL7702细胞MAPK、PI3K/Akt通路的变化及LC的影响;应用相应抑制剂,分析JNK、ERK、p38MAPK在H_2O_2损伤HL7702细胞中的作用;采用Akt抑制剂IV评价Akt是否参与了LC的保护作用以及LC对Nrf_2/HO-1通路的激活作用。4.LC对H_2O_2损伤HL7702细胞脂肪酸代谢、能量代谢相关基因表达的影响:Western blot技术检测过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptors-α,PPAR-α)的经时表达,并从m RNA和蛋白水平测定LC对PPAR-α及其下游基因肉毒碱棕榈酸转移酶1(CPT1)、脂肪酰基辅酶A氧化酶(ACOX)的影响;分析PPAR-α在LC保护细胞损伤中的作用及与SOD、CAT的相关性;测定H_2O_2损伤HL7702细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的经时变化特点及LC的调节作用;应用相应抑制剂分析AMPK在LC保护细胞损伤中的作用以及PI3K/Akt、AMPK与GSK-3β的级联关系。结果:1.以0.3 mmol/L H_2O_2损伤HL7702细胞12 h为病理模型。0.1?1.0 mmol/L LC剂量依赖性抑制了H_2O_2引起的细胞活性降低及LDH释放(P0.05,P0.01)。与正常对照组相比,H_2O_2损伤组细胞SOD和CAT蛋白表达水平显著下降(P0.01),SOD和CAT活性分别下降了30.07%和38.26%,ROS及MDA水平显著增加,分别为对照组的3.8倍和1.7倍;LC能够抑制H_2O_2引起的SOD、CAT蛋白表达及活性的降低,以及ROS、MDA水平的增加(P0.05,P0.01)。2.经时表达分析发现,H_2O_2损伤1 h细胞核Nrf_2表达迅速升高,随后逐渐降低,HO-1表达呈逐渐上升趋势;LC预孵育对H_2O_2诱导的Nrf_2核转位、Nrf_2-DNA结合活性升高及HO-1蛋白表达增加均有明显促进作用(P0.05);Nrf_2 si RNA技术将细胞Nrf_2沉默后,抑制了LC的保护作用及增强HO-1表达的作用。3.H_2O_2损伤后p-JNK、p-ERK、p-p38MAPK表达均迅速升高,p-Akt表达呈先升高后降低的双相改变;LC能有效抑制H_2O_2引起的p-JNK、p-p38MAPK表达升高(P0.05,P0.01),但对p-ERK表达无明显影响;LC既能增强损伤1 h时p-Akt的升高(P0.01),又能抑制损伤12 h时p-Akt的降低(P0.01)。除ERK抑制剂外,JNK、p38MAPK、Akt抑制剂均能有效抑制H_2O_2引起细胞活性降低(P0.05),且Akt抑制剂也抑制了LC对Nrf_2/HO-1通路的激活作用。4.本研究首次发现,H_2O_2损伤肝细胞时PPAR-α蛋白表达逐渐降低;LC预孵育能增强PPAR-α及其下游基因CPT1、ACOX的表达(P0.05,P0.01);PPAR-α激动剂能有效抑制H_2O_2引起的SOD、CAT活性及细胞活性的降低;PPAR-α抑制剂阻断了LC增强SOD、CAT表达及细胞活性的作用。p-AMPK、p-GSK-3β表达在H_2O_2损伤后逐渐降低,LC对其均有明显抑制作用(P0.01),且能抑制AMPK上游激酶肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)及下游底物乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-Co A carboxylase,ACC)的活性降低(P0.05,P0.01)。AMPK抑制剂阻断了LC增强细胞活性及p-GSK-3β表达的作用,Akt抑制剂对LC增强p-GSK-3β表达的作用无影响。结论:1.LC保护H_2O_2损伤HL7702细胞的作用与升高SOD、CAT活性,降低ROS及MDA水平有关。2.LC通过激活Akt/Nrf_2/HO-1通路保护H_2O_2诱导的HL7702细胞损伤。3.JNK、p38MAPK的激活参与H_2O_2损伤HL7702细胞,LC的保护作用与抑制JNK、p38MAPK的激活有关;ERK未参与H_2O_2的损伤作用,且与LC的保护作用无关。4.PPAR-α参与了H_2O_2诱导的HL7702细胞损伤。LC通过增加PPAR-α及其下游基因CPT1、ACOX表达,激活LKB1/AMPK/ACC通路,抑制GSK-3β活性而保护H_2O_2诱导的HL7702细胞损伤,且PPAR-α表达增加与SOD、CAT的表达增加有关。
[Abstract]:Objective : L - carnitine ( LC ) , also known as L - carnitine , is a kind of vitamin nutrient necessary for human body and is rich in animal food . )娉曟娴嬬粏鑳炴椿鎬，
本文编号：1884658
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yufangyixuelunwen/1884658.html
