三氧化二砷导致人体细胞中组蛋白H4K16乙酰化水平下调的作用机制研究

发布时间：2021-03-31 17:39

表观遗传机制,如组蛋白翻译后修饰,能够可遗传地调控大多数与细胞生命进程相关基因的表达。外界环境对细胞的刺激,会改变细胞内组蛋白翻译后修饰,引起染色质结构变化,从而影响基因的表达。砷化合物(三氧化二砷)是一类公认的致癌物,也是饮用水的主要污染物之一,三氧化二砷引起的饮用水污染是世界性环境问题。而另一方面,三氧化二砷还是临床治疗急性早幼粒细胞性白血病(APL)最有效的药物之一,但如何降低三氧化二砷对人体的毒副作用一直是一个难题。越来越多的证据表明砷化合物介导的表观遗传调控与其毒理和药理作用密切相关。有文章报道,三氧化二砷能够引起UROtsa细胞内组蛋白H4K16位赖氨酸乙酰化(H4K16ac)水平下降,但此过程中三氧化二砷的具体作用机制还不明确,其是否作用于催化H4K16ac的组蛋白乙酰转移酶h MOF(MYST1/KAT8,human male absent on first)还不为人所知。本论文对这一机制进行了深入研究,通过一系列生化实验及敲低/过表达h MOF的细胞实验,证实三氧化二砷调控的细胞内H4K16ac水平下降,很大程度是由于砷原子与组蛋白乙酰转移酶(HAT)h MOF之间的直接结合所导致的h MOF酶活性缺失造成的。本论文的实验结果表明,三氧化二砷处理He La细胞或HEK293T细胞24、48和72h,均能观察到组蛋白H4K16ac水平随三氧化二砷浓度的升高而降低,而组h MOF的转录和表达水平并未发生明显变化。本文通过体外组蛋白乙酰转移酶活性检测(HAT assay)证明,三氧化二砷直接抑制了h MOF的酶活性。为了探明二者的相互作用机制,我们用氨基苯基氧化砷(PAPAO)与琼脂糖凝胶树脂交联,构建出As-亲和树脂(As-activated agarose),利用As-亲和沉淀实验证明砷原子能直接结合h MOF。同时,采用MAIDI-TOF质谱检测和紫外光谱吸收实验证明,砷原子直接结合在h MOF锌指结构的C2HC部位。细胞实验表明,过表达h MOF不仅降低了三氧化二砷对HEK293T细胞的毒性,同时还有效地逆转了三氧化二砷引起的细胞内H4K16ac水平降低。而且在He La细胞中敲低h MOF,可以增加三氧化二砷引起的细胞坏死和凋亡。实验证明,三氧化二砷能够上调HEK293T细胞中去乙酰转移酶HDAC4的表达,但用si RNA敲低HDAC4并不影响H4K16ac的乙酰化水平,也无法抑制三氧化二砷导致的H4K16ac水平下降,这些结果表明HDAC4可能不直接参与组蛋白H4K16的乙酰化。通过在HEK293T细胞中的染色质免疫沉淀(CHIP)检测,我们证实三氧化二砷可以阻断h MOF在HDAC4转录起始区域(-1890、-476和+588 kb位点)的募集,并上调HDAC4的转录和表达。综上所述:本文首次证明三氧化二砷直接结合在组蛋白乙酰转移酶h MOF锌指结构的C2HC部位,抑制h MOF的乙酰转移酶活性,从而下调细胞内H4K16ac水平,并导致HDAC4表达水平升高。同时,h MOF催化的组蛋白H4K16ac修饰,能够提高人体细胞对三氧化二砷毒性的抵抗力。本文关于三氧化二砷对h MOF以及H4K16乙酰化修饰的表观遗传调控机制的研究,为今后阐明砷化合物的毒理和药理作用机理提供了新的研究方向。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114

文章目录

摘要

Abstract

缩略词

第1章绪论

1.1 表观遗传学与组蛋白修饰

1.1.1 表观遗传学概述

1.1.2 组蛋白修饰

1.2 组蛋白乙酰转移酶hMOF与组蛋白H4K16ac

1.2.1 组蛋白乙酰转移酶hMOF

1.2.2 组蛋白去乙酰转移酶HDACs

1.2.3 组蛋白H4K16ac

1.3 三氧化二砷概述

1.3.1 三氧化二砷的危害及应用

1.3.2 三氧化二砷的作用机制

1.3.3 三氧化二砷与表观遗传修饰

1.4 立题依据与研究意义

1.4.1 立题依据

1.4.2 研究意义

第2章三氧化二砷对组蛋白H4乙酰化修饰及hMOF表达和转录水平的调控作用

2.1 引言

2.2 材料与仪器

2.2.1 细胞

2.2.2 抗体

2.2.3 RT‐PCR引物

2.2.4 实验试剂

2.2.5 实验仪器

2.3 试验方法

2.3.1 三氧化二砷（As2O3）储液的配制

2.3.2 细胞培养与三氧化二砷处理

2.3.3 Western blot检测

2.3.4 Western blot数据分析

2.3.5 免疫荧光染色（Immunofluorescence Staining）

2.3.6 RNA提取

2.3.7 反转录

2.3.8 Realtime PCR反应

2.3.9 hMOF萤光素酶报告基因检测

2.4 实验结果

2.4.2 三氧化二砷对组蛋白H4乙酰化修饰的调控

2.4.3 三氧化二砷不影响hMOF的转录水平

2.4.4 三氧化二砷不影响细胞中hMOF的蛋白表达水平

2.5 小结

第3章三氧化二砷对hMOF乙酰转移酶活性的调控机制研究

3.1 引言

3.2 材料与仪器

3.2.1 细胞

3.2.2 抗体

3.2.3 重组质粒

3.2.4 合成肽

3.2.5 实验试剂

3.2.6 实验仪器

3.3 试验方法

3.3.1 HA‐h MOF重组蛋白在Sf21昆虫细胞中的表达纯化

3.3.2 体外HAT活性检测（HAT assay）

3.3.3 As‐immobilized agarose的构建

3.3.4 Western blot检测

3.3.5 Western blot数据分析

3.3.6 Arsenic‐immobilized agarose亲和沉淀实验

3.3.7 hMOF合成肽的体外合成

3.3.8 MALDI‐TOF MS

3.3.9 紫外吸光度检测

3.3.10 hMOF三结构维模型的构建

3.4 实验结果

3.4.1 三氧化二砷抑制hMOF的乙酰转移酶活性

3.4.2 三氧化二砷与hMOF直接相互结合

3.4.3 三氧化二砷与hMOF结合位点的确认

3.4.4 砷原子与hMOF结合的三维结构模拟

3.5 小结

第4章三氧化二砷对组蛋白去乙酰转移酶HDAC4的调控机制研究

4.1 引言

4.1.1 染色质免疫沉淀（CHIP）

4.2 材料与仪器

4.2.1 细胞株

4.2.2 抗体

4.2.3 siRNA

4.2.4 RT‐PCR引物

4.2.5 HDAC4 CHIP引物

4.2.6 实验试剂

4.2.7 实验仪器

4.3 试验方法

4.3.1 细胞培养及三氧化二砷处理

4.3.2 Western blot检测

4.3.3 Western blot数据分析

4.3.4 免疫荧光染色

4.3.5 过表达hMOF

4.3.6 si RNA敲低hMOF及HDAC4

4.3.7 DNA芯片数据分析

4.3.8 hMOF在HDAC4上的CHIP

4.4 实验结果

4.4.1 三氧化二砷对HDACs蛋白表达水平的影响

4.4.2 敲低hMOF上调HDAC4的转录和表达

4.4.3 HDAC4不调控细胞内H4K16ac水平

4.4.4 三氧化二砷阻断hMOF在HDAC4转录起始位点的募集

4.5 小结

第5章h MOF降低三氧化二砷的细胞毒性

5.1 引言

5.1.1 线粒体膜电位检测（JC‐1 染色）

5.2 材料与仪器

5.2.1 细胞

5.2.2 抗体

5.2.3 重组质粒

5.2.4 siRNA

5.2.5 实验试剂

5.2.6 实验仪器

5.3 试验方法

5.3.1 hMOF在HEK293T细胞中的过表达

5.3.2 Lipofectamine RNAiMAX转染siRNA

5.3.3 Western blot检测

5.3.4 Western blot数据分析

5.3.5 MTT实验

5.3.6 流式细胞分析

5.3.7 JC‐1 染色

5.4 实验结果

5.4.1 过表达hMOF逆转三氧化二砷对H4K16ac的下调

5.4.2 过表达hMOF抑制三氧化二砷上调HDAC4

5.4.3 过表达hMOF增强细胞对三氧化二砷的抗性

5.4.4 敲低hMOF增强HeLa细胞对三氧化二砷敏感性

5.5 小结

第6章结论与展望

6.1 结论

6.2 后续展望

参考文献

作者简介及在学期间所取得的科研成果

致谢

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