镉对内质网应激和Nrf2信号通路的影响及其调控机制研究

发布时间：2018-06-09 03:30

本文选题：镉 + 氧化应激　；参考：《广东药科大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景及目的镉作为重要的生产性毒物和环境污染物,主要引起慢性肾损伤,而氧化应激被认为是镉致肾氧化损伤的重要机制。不少研究表明,镉可诱导机体产生过量ROS,使氧化/抗氧化系统失衡,最终导致各系统氧化损伤。镉可通过以下途径对肾脏产生氧化损伤:(1)降低机体抗氧化能力。镉可以与超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GSSG-R)的巯基结合,与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)中的硒(Se)形成Cd-Se复合物,并能降低内源性抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的水平,从而使这些酶的抗氧化活力降低或丧失。(2)诱导机体产生过量自由基,使细胞氧化/抗氧化水平失衡。在细胞呼吸过程中,镉可以损伤线粒体,协同铜和铁离子产生氧自由基;2价镉离子与DNA结合蛋白“锌指”结构中的锌离子发生置换,产生自由基;镉也可以通过活化血红素氧化酶、黄嘌呤氧化酶使机体产生过量的超氧自由基。(3)镉可以引起炎症反应,活化的炎症细胞可以释放多种细胞因子,从而对机体产生氧化损伤。镉通过上述途径产生的氧自由基,可引起细胞DNA氧化损伤,进而导致细胞凋亡。内质网是细胞内重要亚细胞器之一,其主要功能是使蛋白质合成和被修饰与加工后,正确折叠、组装和运输。当细胞受到体内外氧化应激后,内质网将产生未折叠蛋白/错误折叠蛋白积聚,诱发内质网发生不同程度的内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)。最近有报道认为,镉诱导细胞ROS的生成可触发ERS反应。但镉是如何通过ROS诱导肾细胞发生内质网应激,其机制仍需深入探讨。转录因子NF-E2相关因子2(Nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)信号通路是细胞抗氧化应激的中枢调节者,可以有效清除自由基、对抗致癌中间物、参与抗氧化蛋白酶的表达与调控,在细胞介导的抗氧化应激防御反应中具有重要的作用。在镉诱导机体产生过量自由基而导致氧化损伤的过程中,过量自由基可触发细胞Nrf2信号通路介导的抗氧化机制以及抑制细胞的炎症通路的启动,可以有效清除自由基、促进DNA损伤修复、对抗致癌中间物、参与抗氧化蛋白酶及Ⅱ相代谢酶基因的表达与调控,在镉暴露导致的肾脏损伤中具有重要的拮抗作用。可是,在镉毒性作用下,Nrf2信号通路的具体调控机制仍需进一步研究。近年来,有研究提出,Nrf2信号通路可被未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)激活,Nrf2作为蛋白激酶样内质网激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)的底物可被PERK磷酸化,从而实现跨核膜转运并与抗氧化反应元件(Antioxidant response element,ARE)结合,启动Nrf2-ARE信号通路。但研究在镉致人肾细胞毒性作用中ERS和Nrf2之间的相互调控机制却报道甚少。目前,关于镉对ERS和Nrf2信号通路的影响及其调控作用研究基本上都是基于动物和细胞的研究,而通过工人的研究来探讨镉对职业作业工人ERS和Nrf2信号通路的影响,国内外尚未见报道。因此,本研究先选择职业镉暴露工人,观察镉对工人肾功能损伤、氧化应激、ERS和Nrf2的影响;再通过建立HEK细胞镉中毒模型,检测细胞存活率、氧化应激、ERS和Nrf2相关基因与蛋白表达的变化,以揭示镉对氧化损伤、ERS与Nrf2影响的分子毒理学机制;最后应用ERS、Nrf2的诱导剂与抑制剂,从正反两方面来探讨镉毒作用过程中ERS和Nrf2信号通路的相互调控机制,从而为深入研究镉毒作用机制以及镉中毒的防治提供实验证据。方法1实验方法1.1人群实验方法1.1.1样品的采集与处理选择34名职业镉作业工人,按《工作场所有害物质监测方法》对工人进行尿、血样的采集,样品收集后,贴上受检人员姓名、编号、日期等标签,放置于4℃的冰箱内立即送检,-20℃冰箱保存待检。1.1.2指标的测定应用石墨炉原子吸收法对尿、血镉进行检测;采用羟胺法、酶促反应法和硫代巴比妥酸比色法测定氧化应激指标;采用胶乳增强免疫比浊法和可见分光光度计比色法检测尿β2-微球蛋白(β2-MG)含量和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活力、尿肌酐;采用全自动生化鉴定仪对尿白蛋白(ALB)含量、血尿酸和血尿素氮指标进行检测;采用酶联免疫吸附法对8-OHd G、PERK和Nrf2含量进行测定。1.2细胞实验方法1.2.1实验分组设计1.2.1.1对照组:加入等体积无Cd Cl2的10%DMEM培养基。1.2.1.2氯化镉(Cd Cl2)单独作用组:用浓度为2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒HEK细胞24h、48h和72h。。1.2.1.3 ERS增强剂杆菌肽预处理组:应用0.5 mmol/L杆菌肽预处理12h后,加入浓度为2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒细胞24h、48h和72h。1.2.1.4 ERS阻滞剂牛磺脱氧胆酸(TUDCA)预处理组:用50μmol/L TUDCA预处理12h后,加入浓度为2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒细胞24h、48h和72h。1.2.1.5 Nrf2诱导剂叔丁基对苯二酚(t BHQ)预处理组:用50μmol/L t BHQ预处理12h后,加入浓度为2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒细胞24h、48h和72h。1.2.1.6 Nrf2抑制剂木犀草素(Luteolin)预处理组:用10μmol/L Luteolin预处理12h后,加入浓度为2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒24h、48h和72h。1.2.2 HEK细胞增殖活性测定以浓度为2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒HEK细胞24h、48h和72h后,用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖活性情况。1.2.3 HEK细胞氧化应激水平测定以浓度为2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的Cd Cl2溶液染毒HEK细胞24h、48h和72h后,测定HEK细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)与8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)含量反映细胞氧化应激水平。1.2.4 HEK细胞基因表达测定将细胞接种于6cm培养皿中,按1.2.1实验分组处理细胞,用RNAiso Plus试剂提取细胞总RNA,采用q RT-PCR法检测各组细胞内ERS与Nrf2信号通路相关基因的表达。1.2.5 HEK细胞蛋白翻译测定将细胞接种于10cm培养皿中,按1.2.1实验分组处理细胞,按Nuc Buster TM Protein Extraction Kit试剂盒说明书提取浆蛋白和核蛋白,蛋白定量后用Western blotting技术检测细胞内Bip、PERK和Nrf2蛋白的翻译水平。2统计分析采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料经正态性检验服从正态分布者,以(?)±s描述。满足正态性分布且方差齐的两组之间差异的比较用两组独立样本的t检验,多组均数间显著性差异检验采用单因素方差分析,组间两两比较用LSD检验法,检验水准α=0.05。结果1镉对工人氧化应激、ERS与Nrf2的影响1.1工人尿、血镉含量的分析在工人没有慢性轻度镉中毒的前提下,女工的尿镉含量水平显著高于男工(P0.05);随年龄的增长,30~57岁年龄阶段的工人血镉含量水平有逐渐下降趋势;工龄超过10年的工人尿镉含量有所增高,说明暴露在镉作业环境的时间越长,镉在体内蓄积得越多,因此尿液中镉含量较高。年龄、工龄两因素分别与尿镉、血镉之间均不存在相关性,差异均无统计学意义(P0.05)。1.2镉对工人肾功能损伤的影响在各尿、血镉水平条件下,工人尿β2-MG、ALB含量、NAG活力与血尿酸、尿素氮含量均无统计学意义的改变(P0.05),表明在各尿、血镉水平条件下,镉没有引起工人肾功能损伤的改变。1.3镉对工人氧化应激的影响较小于3μg/L和大于5μg/L血镉水平,在3~5μg/L血镉水平条件下,工人体内抗氧化酶SOD与GSH-Px活性显著地增高(P0.05),而脂质过氧化产物MDA与DNA氧化修饰产物8-OHd G的含量明显地降低(P0.05)。1.4镉对工人ERS和Nrf2的影响与小于3μg/L和大于5μg/L血镉水平比较,在3~5μg/L血镉水平条件下,PERK和Nrf2蛋白含量显著地升高(P0.05)。说明在3~5μg/L血镉水平条件下,镉可诱导工人ERS反应与Nrf2转录因子的表达。1.5不同性别对工人肾功能损伤的影响与男工比较,女工尿β2-MG、ALB、NAG以及血尿酸、尿素氮均无统计学意义的改变(P0.05)。说明性别的差异对肾功能损伤没有影响。1.6不同性别对工人氧化应激的影响男女工人体内抗氧化酶SOD和GSH-Px活力水平无统计学意义的变化(P0.05)。体内脂质过氧化产物MDA与DNA氧化修饰产物8-OHd G含量,男女之间也无差异(P0.05)。表明镉在男女工人体内蓄积虽有不同,但并没有引起氧化应激反应。1.7不同性别对工人ERS和Nrf2的影响工人体内PERK蛋白与Nrf2蛋白含量在不同性别之间没有统计学意义的改变(P0.05)。表明性别对ERS反应与Nrf2没有影响。2镉对HEK细胞ERS与Nrf2信号通路的影响2.1镉对HEK细胞增殖活性的影响在2.5~20.0μmol/L剂量条件下作用24、48与72h,随着染镉浓度的增高与作用时间的延长,HEK细胞相对存活率逐渐降低。表明HEK细胞的增殖活性受镉的抑制。2.2镉对HEK细胞氧化应激的影响镉在2.5~20.0μmol/L剂量条件下作用24、48与72h,随着染镉浓度的增加与作用时间的延长,HEK细胞脂质过氧化产物MDA与DNA氧化修饰产物8-OHd G含量有逐渐升高趋势,但抗氧化酶SOD和GSH-Px活性呈逐渐降低趋势。说明镉诱导HEK细胞氧化损伤产物的形成,同时也抑制抗氧化酶活性,导致氧化损伤的加重,这可能与其抑制HEK细胞增殖活性有关。2.3镉对HEK细胞ERS的影响在镉毒性作用下,HEK细胞Bip、PERK m RNA与蛋白、ATF4 m RNA表达有不同程度的变化,且镉在10.0、20μmol/L剂量条件下作用72h,可显著上调Bip、PERK m RNA与蛋白、ATF4 m RNA的表达(P0.05)。2.4镉对HEK细胞Nrf2信号通路的影响镉在2.5~20.0μmol/L条件下作用48h与72h,Nrf2 m RNA与蛋白表达随染毒剂量增加而逐渐上升。故随剂量增高,镉触发ERS反应增强的同时,也诱导了Nrf2 m RNA与蛋白表达的上调。此外,镉在20.0μmol/L条件下作用48h,可显著上调Nrf2 m RNA与蛋白及其介导的下游Ⅱ相解毒酶基因的表达,说明镉可诱导Nrf2信号通路介导的Ⅱ相解毒酶基因表达的上调。3 ERS与Nrf2信号通路在镉致HEK细胞氧化损伤中的相互调控作用3.1镉诱导HEK细胞ERS对Nrf2信号通路的调控作用3.1.1 ERS增强对染镉HEK细胞ERS和Nrf2相关基因和蛋白表达影响经杆菌肽预处理后,镉在2.5~20.0μmol/L剂量条件下作用24h、48h与72h,随染毒剂量增加与作用时间延长,Nrf2表达随ERS相关分子表达总体上有逐渐上升趋势,其中,与同组对照组比较,杆菌肽+各剂量Cd Cl2组相关基因和蛋白表达水平多上调;与相同剂量单染镉组比较,杆菌肽+各剂量Cd Cl2组Bip、PERK、Nrf2 m RNA和蛋白表达均显著升高(P0.05)。故ERS的增强可诱导Nrf2表达上调。3.1.2 ERS阻滞对染镉HEK细胞ERS和Nrf2相关基因和蛋白表达影响经TUDCA预处理后,镉在2.5~20.0μmol/L剂量条件下作用24h、48h与72h,随染毒剂量增加与作用时间延长,Nrf2表达随ERS相关分子表达总体上有逐渐升高趋势,其中,与同组对照组比较,TUDCA+各剂量Cd Cl2组相关基因和蛋白表达水平均升高;与相同剂量单染镉组比较,TUDCA+各剂量Cd Cl2组Bip、PERK、Nrf2 m RNA和蛋白表达均显著下调(P0.05)。故ERS的抑制可诱导Nrf2表达下调。3.2 Nrf2对镉诱导HEK细胞ERS的反馈调节作用3.2.1 Nrf2诱导对染镉HEK细胞ERS和Nrf2相关基因和蛋白表达影响经t BHQ预处理后,镉在2.5~20.0μmol/L剂量条件下作用24h、48h与72h,随染毒剂量增加与作用时间延长,Nrf2表达和ERS相关分子表达总体上有逐渐上升趋势,其中,与同组对照组比较,t BHQ+各剂量Cd Cl2组相关基因和蛋白表达水平均有不同程度的升高;与相同剂量单染镉组比较,t BHQ+镉在2.5~20.0μmol/L剂量条件下作用24h,Nrf2浆蛋白表达明显上调(P0.05),浆核比无显著改变,但Bip、PERK m RNA和蛋白表达水平有所上升。说明t BHQ可上调Nrf2 m RNA和蛋白表达,而下调Bip、PERK m RNA和蛋白表达。故在一定程度上,经PERK-Nrf2信号途径介导的Nrf2信号通路的激活可缓解ERS反应。3.2.2 Nrf2抑制对染镉HEK细胞ERS和Nrf2相关基因和蛋白表达影响经Luteolin预处理后,镉在2.5~20.0μmol/L剂量条件下作用24h、48h与72h,随染毒剂量增加与作用时间延长,Nrf2表达和ERS相关分子表达总体上有逐渐上升趋势。其中,与同组对照组比较,Luteolin+各剂量Cd Cl2组Nrf2、Bip、PERK基因和蛋白表达水平均有不同程度的升高,而Luteolin+镉在2.5~20.0μmol/L剂量条件下作用48h与72h,浆核比显著上升(P0.05);与相同剂量单染镉组比较,Luteolin+各剂量Cd Cl2组Nrf2、PERK基因和蛋白表达水平有所下降,但Bip基因和蛋白表达有所上升。表明Luteolin抑制PERK介导的Nrf2后,可引起ERS标志性分子Bip的过表达。结论1在没有慢性轻度镉中毒的前提下,镉未引起工人肾功能损伤的改变,但较小于3μg/L和大于5μg/L的血镉浓度,在3~5μg/L血镉水平条件下,镉触发了工人内质网应激反应,并通过激活PERK介导的Nrf2转录因子,诱导其下游抗氧化酶活性的升高,从而抑制了氧化损伤产物的生成,最终起到抗氧化作用;虽然镉在女工体内蓄积水平较高,但未引起肾功能、氧化应激、ERS与Nrf2的改变。2镉在一定剂量条件下作用一定时间,可诱导HEK细胞氧化损伤产物的生成,并抑制抗氧化酶活性,两者共同作用导致细胞氧化损伤的加重,这可能与其抑制HEK细胞增殖活性有关;在镉毒作用过程中,HEK细胞可通过PERK-Nrf2信号途径激活Nrf2,上调其下游Ⅱ相解毒酶基因的表达;在应用杆菌肽、TUDCA使ERS增强与阻滞后,ERS可正向调节Nrf2的表达;而在应用t BHQ、Luteolin诱导与抑制Nrf2表达后,Nrf2可反馈性地调节ERS反应的强度。3本研究通过开展镉暴露的分子流行病学和分子毒理学研究,揭示了镉引起作业工人和HEK细胞氧化应激时,对ERS和Nrf2信号通路的作用及其调控机制,不仅丰富了镉的毒理学机制,而且为镉职业中毒的防治提供了学术依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R114

【参考文献】