阪崎肠杆菌快速检测方法的建立及其特异性抗原的筛选与验证

发布时间：2018-07-01 18:28

  本文选题：阪崎肠杆菌 + 抗体　； 参考：《南昌大学》2012年硕士论文

【摘要】：阪崎肠杆菌(Cronobacter spp.)是一种重要的食源性条件致病菌,能够引起严重的新生儿脑膜炎、坏死性结肠炎和菌血症等疾病,导致较高的死亡率(40‰80%)和严重的神经系统损伤后遗症,以及发育障碍。加强对食品中阪崎肠杆菌的早期监控及其引起的疾病诊断,对于预防和控制大规模感染疫情的爆发具有重要意义。为此,本研究拟建立针对奶粉样本中阪崎肠杆菌的快速、灵敏、准确的检测平台。本文利用纳米磁珠,结合免疫学与分子生物学的技术手段,创建了检测奶粉样本中阪崎肠杆菌的免疫磁珠和探针磁珠捕获的方法。采用阪崎肠杆菌菌体碎片作为免疫原进行动物免疫,制备获得了效价为106的多克隆抗体；采用菌体逆向吸附法和辛酸硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体,有效消除了多抗与副溶血弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的交叉反应,获得了特异性的阪崎肠杆菌抗体。利用纯化后的抗体偶联于纳米磁珠表面,制备能够特异性识别、捕获阪崎肠杆菌的免疫磁珠,结合巢氏PCR检测技术,其检测限可达5CFU/mL。同时,利用阪崎肠杆菌的特异性探针和纳米磁珠制备的核酸探针磁珠,捕获样本中的目的基因序列,其检测灵敏度为103 CFU/mL。以上两种方法均不受高浓度杂菌和奶粉样品本身干扰,可有效用于食品中阪崎肠杆菌的检测。本研究筛选制备了抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体,并建立了两种特异性检测阪崎肠杆菌的免疫试纸条方法—胶体金试纸条和荧光微球试纸条。通过奶粉样本的实际检测评估,表明胶体金试纸条和荧光微球试纸条检测阪崎肠杆菌灵敏度分别为106CFU/mL和105 CFU/mL,可在15 min完成检测；并且不受高浓度杂菌和奶粉样品本身干扰。以上方法的建立为实现应用于基层的检测阪崎肠杆菌试纸条的商业开发提供了技术基础。为了改进阪崎肠杆菌定性定量的检测方法,本研究利用消除了交叉反应的阪崎肠杆菌多抗,通过Western Blotting筛选到4种阪崎肠杆菌的蛋白抗原(ATPsyn, Maltoporin, CP783, OmpA)。其中ATPsyn, Maltoporin, CP783分别被克隆表达,经、Vestern Blotting验证,CP783可作为特异性抗原,并制备相应的多克隆抗体,进一步检验了CP783可以作为阪崎肠杆菌特异性检测抗原。此外本文分析了阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶、OmpA和CP783的抗原表位,选取特异性肽段,获得对应的单克隆抗体,发现3个蛋白的单抗均可识别所有阪崎肠杆菌。然而,单抗均与部分非阪崎肠杆菌存在交叉反应,不适合用于阪崎肠杆菌的特异性检测。目前,阪崎肠杆菌的免疫学检测方面的研究在国内外报道较少。本文的研究成果将有助于建立阪崎肠杆菌的快速检测平台,开拓食品安全检测的新方法,为阪崎肠杆菌的监测提供了有效的检测技术手段,同时也为阪崎肠杆菌特异性抗原的筛选和验证提供了前期探索,为阪崎肠杆菌特异性蛋白抗原的研究提供了工作基础。
[Abstract]:Cronobacter spp. It can cause severe neonatal meningitis, necrotizing colitis, bacteremia and other diseases, leading to higher mortality (40 鈥，

本文编号：2088681