异鼠李素对突变亨廷顿蛋白细胞毒性的影响及机制研究

发布时间：2018-10-16 13:30

【摘要】：亨廷顿病（Huntington’s disease,HD）是一种常染色体显性遗传的神经系统退行性疾病，影响肌肉的协调并导致认知功能减退和痴呆。HD由HD基因突变导致。HD基因可编码亨廷顿蛋白（huntingtin，Htt）。在正常人群中，HD基因中CAG的重复数为10-35个。当HD基因发生突变，CAG重复数超过35时便出现HD。突变HD基因的第一外显子中的CAG重复序列异常增加（超过35次），其编码的Htt氨基末端中的谷氨酰胺重复序列异常扩展。这种突变可导致纹状体(尾状核和壳核)内中等大小有棘神经元细胞死亡，尤其是投射性GABA神经元和III、V、VI层大脑运动皮层的锥体细胞发生退行性变和死亡，这些与纹状体的萎缩有关。目前减缓HD进展的方法有：减少的突变Htt的产生；提高细胞的生存能力，更换丢失的神经元等。正常Htt在神经元胞质内呈弥散分布，而在HD患者和HD转基因动物模型的脑内，突变Htt在细胞内错误折叠而形成不可溶的聚集物定位在神经元核内和突起(包括轴突和轴突终末)内，分别称为核内聚集物(intranuclear aggregates)和神经毡聚集物(neuropil aggregates)。这种聚集物在HD的发病过程中扮演着重要角色。尽管HD的发病基因已被找到，但发病的机制目前还不清楚，至今也无有效治疗HD的方法。真核细胞主要通过泛素-蛋白酶体与自体吞噬系统降解蛋白质，增强突变Htt的清除对于防止亨廷顿病病理发生至关重要，这一过程主要由泛素-蛋白酶体与自体吞噬途径介导。大量体外和体内实验证据表明，，在HD中，突变Htt可诱发氧化应激，后者可进一步损坏UPS功能而导致突变Htt聚集。因此，抗氧化药物已经成为治疗HD的一大焦点。黄酮类化合物是有超过6000个不同的化合物的植物次生代谢产物的一个大集团。对黄酮类化合物的大量观测，在体内和体外实验都表明其生理和生物学效应广泛。生物学功能如抗过敏，抗炎，抗病毒，抗癌和抗增殖活性，这些早已被确认。几种黄酮类化合物已被证明对各种诱变剂或致癌物质的具有抗突变作用。黄酮类化合物还能发挥多重保护作用，包括潜在的神经元损伤保护作用；抑制发炎反应；和潜在的促进学习，记忆与认知的功能等。异鼠李素（Isorhamnetin），也称3,5,7-三羟基-2-(4-羟基-3-甲氧基苯基)苯并吡喃-4-酮，是一种黄酮类化合物，它是希腊和丹麦的一种食品，也存在于中国沙棘果汁中。该药具有抗脂质过氧化，扩冠，抑制血小板聚集，降低大鼠血清和肝脏的胆固醇浓度等功能。本研究利用HD细胞模型观察了异鼠李素对突变Htt细胞毒性的影响并探索其机制。结果表明，异鼠李素能抑制突变Htt细胞毒性，其机制除了其具有的抗氧化作用之外，更重要的是促进了突变Htt的蛋白酶体性和自噬性途径降解。 1.异鼠李素抑制突变Htt对N2a细胞的毒性为探讨异鼠李素对突变Htt毒性的影响，我们分别用1.0μg的cherry-20Q(表达正常htt)或cherry-160Q(突变Htt)质粒瞬时转染N2a细胞，6h后用不同浓度的异鼠李素处理转染的细胞，转染48h后应用台盼蓝（Trypan Blue)染色检测细胞活性。结果表明，异鼠李素处理可明显降低160Q细胞中台盼蓝染色阳性细胞的百分率，说明异鼠李素处理能呈剂量依赖性抑制160Q细胞的活性下降。进一步的内源性激活型caspase3水平的免疫印迹检测显示，异鼠李素处理能呈剂量依赖抑制突变Htt对caspase3的激活。由此表明，异鼠李素对突变Htt的细胞毒性具有明显的抑制作用。 2.异鼠李素能降低表达突变Htt的N2a细胞内聚集型和可容型Htt 为了明确异鼠李素对突变Htt聚集物形成的影响，对表达突变Htt的细胞内聚集物的含量在经异鼠李素处理后的变化进行了检测。在荧光显微镜下观察发现，在经异鼠李素处理后表达160Q的N2a细胞中突变Htt聚集物的数量明显减少。异鼠李素呈剂量依赖性抑制160Q细胞聚集物的形成。通过Western Blot技术，我们发现突变Htt聚集物在表达160Q的细胞内呈时间依赖性增加，异鼠李素处理后，可溶型与聚集型突变亨廷顿蛋白显著降。因此，异鼠李素导致的突变Htt含量减少可能通过促进突变Htt的降解和/或抑制突变Htt聚集所致。 3.异鼠李素减少突变Htt聚集物与Nrf2通路的激活相关为了了解异鼠李素是否通过激活Nrf2通路的来减少突变Htt聚集物，对调节抗氧化反应元件（antioxidant responsive element, ARE）转录因子核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2related factor2, Nrf2）在异鼠李素减少突变聚集物的作用进行了检测。免疫印迹分析显示，异鼠李素处理后的160Q细胞内Nrf2表达水平较未处理的160Q细胞明显升高。同时我们还发现，与未经处理的对照组相比，异鼠李素也增加HO-1蛋白的水平（这是一种细胞保护酶，在炎症过程中防御氧化损伤起关键作用）。这些结果表明，异鼠李素可以激活Nrf2-ARE途径，这被认为是对氧化应激的保护机制；从而降低突变HTT的聚集和毒性作用。因此，异鼠李素减少突变Htt聚集物与Nrf2通路的激活相关。 4.异鼠李素促进突变Htt的蛋白酶体途径和自噬途径降解为了明确蛋白酶体途径是否参与了异鼠李素对突变Htt的降解，首先我们检测了蛋白酶体抑制剂MG132能否阻断异鼠李素对突变Htt的降解作用。免疫印迹结果显示，在异鼠李素处理的160Q中加入MG132可阻断异鼠李素减少聚集型突变Htt的作用，但不能阻断可溶型突变Htt的降低。异鼠李素还可以减少可溶型突变Htt，但MG132不能阻断这一现象，因此，推测其他降解途径可能也参与了异鼠李素促进可溶型突变Htt降解的过程。首先我们考虑是否自噬降解途径参与了这一过程，为此，我们在异鼠李素处理的160Q细胞中加入自噬抑制剂3-Methyladenine(3—MA)。结果显示，3—MA可阻断异鼠李素减少可溶型突变Htt的作用。以上结果显示，异鼠李素通过促进蛋白酶体途径和诱导激活自噬途径降解继而促进聚集型和可溶型突变Htt的降解。结论：异鼠李素可以通过多种途径降解突变Htt:促进蛋白酶体系统降解聚集型突变Htt;诱导激活自噬系统，降解可容型突变Htt;通过促进转录因子核因子E2相关因子2（Nrf2）的表达，进而有效抑制突变Htt的氧化应激作用，促进细胞生存。异鼠李素正是通过以上途径使突变Htt减少是其抑制突变Htt细胞毒性的主要机制。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R114

【共引文献】