氡致人支气管上皮细胞恶性转化过程中p53介导的能量代谢改变

发布时间：2018-11-11 00:18

【摘要】：目的:建立氡染毒和p53敲除人支气管上皮细胞恶性转化模型,探讨p53在氡致人支气管上皮细胞恶性转化过程中,能量代谢途径的改变及其分子机制。方法:(1)利用TALEN技术建立p53敲除人支气管上皮细胞模型。(2)建立氡染毒人支气管上皮(BEAS-2B)细胞和p53敲除人支气管上皮(p53 KO)细胞恶性转化模型。细胞接种于Transwell培养皿置于HD-3型多功能氡室,氡染毒浓度为20000 Bq/m3,染毒时间20 min/次,细胞每次氡染毒后培养3-4天,传代后再进行下一轮氡染毒,重复染毒20次。每5代进行一次细胞增殖活性、软琼脂克隆形成、细胞侵袭和迁移能力的检测。(3)在氡暴露致细胞恶性转化的不同阶段(5、10、15、20、25代),采用生化法检测葡萄糖消耗量、乳酸含量、乳酸脱氢酶含量;采用Seahorse XF细胞外流量分析仪检测细胞氧耗量;采用化学发光法检测ATP含量;real-time PCR检测细胞线粒体DAN拷贝数;JC-1荧光探针流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位;Western blot检测p53、SCO2、TIGAR、三羧酸限速酶(IDH3A、SDHA)、糖酵解限速酶(HK-II、PFKM、PKM2)的蛋白表达水平。结果:(1)基因测序结果TALEN靶点目的片段出现突变,western blot未检测出p53蛋白表达,证实p53基因敲除细胞模型建立成功。(2)与野生型p53BEAS-2B细胞和p53基因敲除细胞p53 KO细胞相比,氡染毒后BEAS-2B-Rn和p53 KO-Rn细胞的软琼脂克隆集落数、细胞侵袭能力和细胞迁移率明显升高,细胞倍增时间不同程度减少。同时,BEAS-2B细胞在氡染毒后第20代开始出现恶性转化,而p53 KO细胞则提前了5代,即从第15代开始即出现恶性转化表型。(3)氡染毒致细胞恶性转化过程中,细胞的葡萄糖消耗量明显增加,乳酸和LDH的含量上升,ATP合成增多,而细胞氧耗量降低。氡染毒BEAS-2B-Rn细胞从第10代开始mtDNA拷贝数增加,并随着传代次数增多而升高。敲除p53基因的p53 KO细胞mtDNA拷贝数和MMP均明显下降,当p53 KO-Rn细胞传至15代出现恶性转化表型时,mtDNA拷贝数显著低于相应传代的BEAS-2B-Rn细胞。同时,MMP明显下降。(4)在BEAS-2B-Rn细胞中,P53蛋白的表达量从第15代时出现下降。氡染毒早期,BEAS-2B-Rn细胞中SCO2和TIGAR的蛋白表达量无明显改变,但在20代时出现蛋白表达量的下降。在p53 KO细胞中,SCO2和TIGAR蛋白表达量低于BEAS-2B细胞,染氡后SCO2蛋白表达持续增加,从第20代开始出现下降,TIGAR蛋白则在染氡后无明显变化。(5)氡染毒后的BEAS-2B-Rn细胞从20代开始IDH3A和SDHA蛋白的表达量下降,p53敲除后SDHA表达明显下降,但对IDH3A表达无影响。在氡染毒早期,BEAS-2B-Rn细胞HK-II蛋白表达增加,并持续到25代。PFKM蛋白则从20代开始表达量增加。PKM2蛋白从第15代开始,随着染氡时间的延长,表达量逐渐升高。p53 KO细胞PFKM蛋白表达高于BEAS-2B细胞;在p53 KO-Rn细胞中,HK-II、PFKM和PKM2的表达未发生相应的改变。结论:(1)成功建立了p53基因敲除的人支气管上皮细胞模型;(2)成功建立了氡染毒致人支气管上皮细胞恶性转化的模型;(3)利用上述模型,研究了氡致细胞恶性转化过程中能量代谢的分子改变,发现氡照射诱导的细胞恶性转化,是线粒体损伤、能量代谢途径改变和p53功能丧失综合作用的结果。P53对线粒体能量代谢的失调是氡致细胞恶性转化中的重要影响因素。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 胡建功,王春阳,宋立刚,孙立新;妊娠滋养细胞肿瘤中p53的表达研究[J];肿瘤防治研究;2004年03期

2 毛晓韵;范垂锋;魏晶;刘崇;姚凡;金锋;;乳腺导管内增生性病变p53外显子突变的研究[J];中国医科大学学报;2011年01期

3 仇加高;;乳腺浸润性导管癌中p53和表皮生长因子受体的表达及其意义[J];实用癌症杂志;2013年01期

4 刘节，，杨淑杰;不同类型卵巢浆液性囊腺肿瘤p53抑癌基因蛋白的表达[J];中华妇产科杂志;1995年11期

5 郭乔楠，陈意生;16例骨原发性恶性纤维组织细胞瘤中p53的表达及其与预后的关系[J];第三军医大学学报;1996年03期

6 阎军峰;头颈部鳞状细胞癌患者P53抗体反应分析[J];国外医学.口腔医学分册;1998年01期

7 胡建功;敖亚洲;谢朝辉;宋立刚;王宁;董雪峰;张祥宏;;P53与妊娠滋养细胞肿瘤的增殖和凋亡[J];基础医学与临床;2007年11期

8 张松涛;张媛媛;张壮;李小玉;李龙江;;重组腺病毒p53影响口腔黏膜异常增生细胞生长的分子机制[J];中国肿瘤;2013年03期

9 曲章义;敏感检测P53突变的变性梯度凝胶电泳法[J];国外医学.遗传学分册;1993年06期

10 莫宏强;赵凤芹;刘晶;;重组腺病毒p53治疗老年恶性胸腔积液的临床研究[J];中国老年学杂志;2009年13期

相关会议论文 前10条

1 孙铁铮;吕厚山;;类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞活化蛋白激酶的持续活化和P53的异常表达[A];中华医学会全国风湿病学年会论文汇编[C];2003年

2 张跃伟;;经皮肝门静脉穿刺序贯注射P53和化疗栓塞治疗原发性肝癌门静脉癌栓疗效观察[A];第十二届全国肝癌学术会议论文汇编[C];2009年

3 靖士侠;彭佐良;孙爱清;;重组人p53腺病毒的药理作用与临床应用[A];2007年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2007年

4 王翔;刘艳辉;毛庆;刘进平;游潮;;突变P53对人脑胶质母细胞瘤化疗敏感性和耐药性的影响及作用机制[A];中国抗癌协会神经肿瘤专业委员会第八届学术会议论文集[C];2011年

5 张晓志;陈泽建;余清;张卫民;彭朝晖;;重组人p53腺病毒制品基础和临床研究进展[A];第三届中国肿瘤学术大会教育论文集[C];2004年

6 刘秀梅;王凯;;原发性干燥综合征唇腺组织中P53及相关基因表达的研究[A];第十二届全国风湿病学学术会议论文集[C];2007年

7 张莉薇;席兴华;;Survivin和P53在翼状胬肉组织中的表达及对其细胞凋亡和增殖的影响[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

8 官泳松;孙龙;贺庆;刘源;;重组人p53腺病毒基因局部注射联合肝动脉化疗栓塞治疗原发性肝癌[A];第一届中国肿瘤微创治疗研讨会暨中国抗癌协会肿瘤微创治疗专业委员会成立大会论文集[C];2005年

9 姜振;;高压氧对递增负荷训练大鼠骨骼肌自由基代谢与P53、Bcl-2蛋白表达的影响[A];第五届全国青年体育科学学术会议、第二届中国体育博士高层论坛论文集[C];2008年

10 陆为民;吴静;沈洪;杨学文;朱萱萱;李克涓;朱长乐;单兆伟;;益气清热方对Ⅰ型幽门螺杆菌感染裸鼠胃粘膜P53、Bcl-2表达的影响[A];中华中医药学会脾胃病分会第二十四次全国脾胃病学术交流会论文汇编[C];2012年

相关博士学位论文 前9条

1 刘超;肝癌非手术患者p53热点突变检测暨人自噬标签Atg8家族蛋白变异剪接本的结构分析[D];复旦大学;2011年

2 刘星;氡致人支气管上皮细胞恶性转化过程中p53介导的能量代谢改变[D];苏州大学;2016年

3 刘军叶;p53对乏氧诱导基因表达的影响及腺病毒载体介导的肿瘤乏氧靶向性基因治疗[D];第四军医大学;2004年

4 饶进军;E1B缺陷型腺病毒抗肿瘤效应与宿主细胞P53及腺病毒受体的关系[D];第一军医大学;2001年

5 何超;TRIM29逆转P53突变型结肠癌奥沙利铂耐药及其机制的研究[D];中南大学;2014年

6 王尧;p53和EAF2双敲除小鼠模型诱导前列腺癌形成机制研究[D];吉林大学;2015年

7 王澜;重组腺病毒介导人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因体外修饰慢性髓性白血病细胞瘤苗的实验研究[D];中国人民解放军军需大学;2001年

8 张建兵;JWA和p53信号通路分子联合预测胃癌预后和在个体化治疗中的意义[D];南京医科大学;2012年

9 周兴;膀胱癌P21WAF1/CIP1、P53和mdr-1基因的表达，相互间的调控及其临床意义[D];中山医科大学;1999年

相关硕士学位论文 前10条

1 郭素珍;子宫内膜癌组织中Maspin、P53水平的表达及其相关性研究[D];河南科技大学;2015年

2 张婷;p53突变对肝癌恶性程度及抗癌药物耐受的影响研究[D];复旦大学;2013年

3 朱涵静;类BRC2肽的固相合成及与靶肽p53(171-192)的相互作用[D];河南工业大学;2015年

4 王贲士;线粒体DNA（mtDNA）D-Loop区突变与P53常见突变位点的相互作用关系及其对大肠癌化疗敏感性的影响[D];济南大学;2015年

5 曹江平;谷胱甘肽过氧化物酶GPX2对p53的调控及作用机制研究[D];天津大学;2014年

6 陈茂山;p53在乳腺癌中的表达及其临床意义[D];重庆医科大学;2015年

7 陈为;肝动脉化疗栓塞术联合重组人p53腺病毒注射液治疗原发性肝癌的临床应用研究[D];中国人民解放军医学院;2012年

8 昝金东;养殖牙鲆肿瘤抑制基因p53的克隆及与淋巴囊肿病关系的研究[D];国家海洋局第一海洋研究所;2007年

9 徐豪杰;鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤中p53、p63表达及临床意义的研究[D];山东大学;2008年

10 马淑颖;鼻腔、鼻窦内翻性乳头状瘤中p53和PCNA的表达及其临床意义[D];天津医科大学;2005年

本文编号：2323978