芒果苷及其衍生物对细胞和斑马鱼的辐射防护效应及作用机理初探

发布时间：2018-12-16 02:41

【摘要】：人类自进入核时代起,就开始寻求能在核事故中起到防护作用或在放疗期间保护正常组织、增加肿瘤放射敏感性的化学品。动物和人类,都暴露在天然或人为来源的电离辐射，如镭射气、宇宙射线以及核医学。电离辐射对生物体构成的损伤，主要来自直接作用和间接作用，其中间接作用引起的损伤占辐射损伤的70-80%左右。这种间接作用通过辐解水产生大量的自由基进而对机体组织和器官造成损伤。这种由辐射引起的氧化应激是许多疾病的关键成因：如甲状腺癌、皮肤癌、乳腺癌以及白血病等。寻找和筛选已有抗氧化剂，缓解或清除辐射所致的大量自由基，提高机体抗放能力，仍是生物医学研究的热点。几类经典的辐射防护剂在动物和细胞中的防护效果及毒性都已被广泛研究[1~2]：内源性的抗氧化剂，如超氧化物歧化酶,可被用于特定的放射治疗步骤；天然抗氧化剂,如维生素E和硒,对由电离辐射诱导的损伤和死亡效果不如WR-2721和WR-151327等硫醇类化合物,但毒副作用小，治疗范围较广；一些具有抗氧化性质的药物单独使用或和其它辐射修饰剂联合使用亦可被用作辐射防护剂。总的来说，现有辐射防护药仍然存在或是防护作用太弱，或是毒副作用太多等许多不足。芒果苷是从知母中分离得到的多酚羟基二苯并吡喃酮类化合物，具有广泛的生物活性:抗氧化、抗炎、抗病毒止痛以及免疫调节等特性[3~5]。有人研究表明[6]，芒果苷苷元可以减少大鼠肠道肿瘤，它可能对肠道细胞有特殊的防护敏感性；Jagetia GC教授等报道，芒果苷可提高受照小鼠的存活率并减轻外周血淋巴细胞的微核率和细胞DNA损伤[7~8]。受此启发，我们合成了一系列芒果苷衍生物，以人肠上皮细胞和斑马鱼为辐射防护效果观察观察对象，希望从中筛选出一些毒性低、防护效果好，有研发前景的新化合物，并且对其作用机理进行初步探讨。研究内容: 1、芒果苷及其衍生物对细胞的辐射防护活性初筛以细胞活力为观察指标，研究芒果苷及衍生物对受一定剂量γ射线照射的HIEC(人肠上皮细胞)和3T3细胞的保护效应，通过细胞存活率的分析初步筛选出具有最佳辐射防护效果的化合物。 2、芒果苷类化合物浓度与辐射防护作用之间的关系选取2种在初筛阶段显示辐射防护效果好的芒果苷类化合物（芒果苷苷元和芒果苷），分别观察不同药物浓度对多种照射剂量HIEC细胞的辐射防护作用，包括：①不同浓度的两药物对不同γ射线照射剂量下细胞存活率的影响；②不同浓度的两药物对不同γ射线照射剂量下细胞克隆形成率的影响；③一定浓度的两药物对照射后细胞凋亡率的影响。 3、芒果苷苷元对斑马鱼的辐射防护效应以斑马鱼为整体动物模型，主要研究：①显微注射芒果苷苷元和芒果苷对不同辐射剂量下不同发育时期的斑马鱼胚胎存活率的影响；②两药物对一定辐射剂量下斑马鱼胚胎孵化率和畸变率的影响；③两药物对一定辐射剂量下斑马鱼组织器官形态的影响。 4、芒果苷类化合物辐射防护的潜在机制研究从自由基和DNA损伤两方面进行初步探讨：①芒果苷苷元及芒果苷清除羟自由基(·OH)的能力；②两药物对辐射引起的DNA双链断裂的影响，检测其是否可减轻辐射诱导的基因毒性。实验方法: 1、芒果苷及所有衍生物合成制备：由第二军医大学药学院有机化学教研室合成、制备和结构确认。所有化合物均溶解于DMSO中，初始浓度为10mg/mL。使用前用双蒸水或RPMI1640培养基稀释到所需浓度。 2、细胞培养：人肠上皮细胞（HIECs）和小鼠3T3细胞（本实验室长期培养）。细胞培养条件：RPMI1640培养基（Invitrogen公司），10%胎牛牛血清（Hyclone公司），37℃，5%CO2，饱和湿气，在细胞培养箱中孵育。 3、动物培养：成年斑马鱼为市售野生型斑马鱼（体长大于3cm），胚胎从上海长海医院心内科实验室获得，按照标准操作规程饲养[9]。饲养条件：光照周期为14h/10h（昼/夜），水温（28±1）℃。 4、γ射线照射：细胞或动物提前给予药物预处理后，用60Co γ射线照射不同剂量，剂量率为1.0Gy/min（第二军医大学辐照中心）。 5、细胞活力测定：用CCK-8法和克隆形成法检测不同处理组细胞的存活率。CCK-8法公式：细胞存活率（%）=（药物组OD值-本底/对照组OD值-本底）×100%；克隆形成法公式：克隆形成率（%）=（克隆数/接种细胞数）/（贴壁存活细胞/接种细胞数） 6、细胞凋亡分析：流式细胞仪检测由辐射因引起的细胞凋亡百分率的变化，Annexin V-FITC/PI双染。 7、斑马鱼胚胎存活率测定：对不同剂量照射后斑马鱼胚胎的死亡率和一定照射剂量下孵化率、畸形率进行检测，并观察各实验组不同时期胚胎发育表型变化。 8、组织病理学变化：HE染色法测定不同处理组成年斑马鱼胃肠道、肝脏和肾脏的形态变化。 9、细胞DNA检测：用γH2AX焦点形成法检测由辐射引发的DNA双链断裂和后续修复。奥林巴斯BX51荧光显微镜测定焦点形成的图像，用image proplus软件计数单个细胞内焦点数量。所得图象在相同设置下对焦点个数进行分析，并用Spssl3.0统计软件进行差异显著性的分析并绘图。 10、测定羟自由基（·OH）：用HPF荧光探针检测芒果苷苷元和芒果苷清除辐解水产生的羟自由基。 11、统计学分析：所有实验数据以x sd表示，单组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析（ANOVA），p0.05为具有统计学差异。实验结果： 1、芒果苷及其衍生物辐射防护活性筛选 1.1芒果苷衍生物辐射防护活性筛选化合物浓度选择：HIEC细胞随照后孵育时间延长（24、48、72h）存活率降低，照前给予不同浓度的芒果苷可提高细胞存活率。照后48h和72h检测细胞活力，均显示芒果苷浓度在70μg/mL时有较好的辐射防护效果，与单纯照射组相比，有显著差异（P0.01）。25个衍生物有不同程度的防护作用。 1.2芒果苷衍生物辐射防护活性筛选辐射剂量选择：随着照射剂量的增大（4、8、12、16Gy），单纯受照的HIEC细胞存活率均出现一定程度的降低，辐射剂量为8Gy时，细胞存活率仅为33.03±0.036%。照前与芒果苷共同孵育，可显著提高HIEC细胞存活率，与单纯照射组相比具有统计学差异（P0.01），此防护效果在时最为显著。 1.3芒果苷衍生物对HIEC细胞的辐射防护效果：所有芒果苷衍生物均可不同程度的提高照后HIEC细胞的存活率，提前给予芒果苷、苷元以及10号化合物后照射，检测细胞存活率分别为：73.2±0.044%，78.3±0.029%，83.8±0.047%，与单纯照射组相比显著提高，具有统计学意义（P0.01）。 1.4芒果苷衍生物对3T3细胞的辐射防护效果：几乎所有芒果苷衍生物均可不同程度的提高照后3T3细胞的存活率。单纯照射3T3细胞存活率仅为40.66±0.024%，照射给予芒果苷、苷元以及21号化合物后照射，检测细胞存活率分别为：61.6±0.038%，69.4±0.042%，64.47±0.038%，与单纯照射组相比显著提高，具有统计学意义（P0.01）。 2、芒果苷苷元对人肠上皮细胞的辐射生物学效应 2.1不同浓度的芒果苷苷元照射后HIEC细胞存活率的影响：辐射防护效果随药物浓度的增大逐渐增加，芒果苷苷元浓度为70μg/mL时，防护作用最为显著（P0.01）。HEIC细胞在4、8、12、16Gy的照射剂量下，芒果苷苷元组存活分数是各单纯照射组的1.52-，2.37-，2.41-，2.4-倍；芒果苷则为1.42-，2.22-，1.99-，1.87-倍。芒果苷苷元和芒果苷均可提高HIEC细胞照后的存活率，有较为显著（P0.05）的防护效果，且芒果苷苷元较芒果苷作用明显。 2.2不同浓度的芒果苷苷元对照射后HIEC细胞克隆形成率的影响：平板克隆实验结果表明，照射前1.5h将细胞与10、20、50、70、100μg/mL的芒果苷苷元共同孵育，存活分数（SF）分别为54.4±0.061%、69.9±0.046%、81.4±0.033%、89.3±0.037%、86.3±0.060%，与单纯照射（40.8±0.043%）组相比明显提高，差异有统计学意义（P0.01）；芒果苷防护效果与苷元类似。 HEIC细胞在8、12、16Gy的照射剂量下，芒果苷苷元组存活分数是各单纯照射组的3.12-，3.91-，4.79-倍；芒果苷为2.04-，2.35-，2.63-倍。用GraphPad Prism5.0软件单靶多击或多靶单击模型拟合剂量-存活曲线，分别求得相应的剂量降低系数（DRF）：芒果苷苷元为1.833；芒果苷为1.52。以上结果提示，照射前给予芒果苷苷元或芒果苷共同孵育，可使HIEC细胞的体外增殖能力明显提高。 2.3一定浓度芒果苷苷元对照射后HIEC细胞凋亡率的影响：流式细胞仪统计处理各组细胞的早期凋亡率，单独给予芒果苷苷元或芒果苷处理的细胞早期凋亡率分别为：2.6％和3.24％，与空白对照组（2.72％）相比，差异无统计学意义（P0.05）。因此，单纯给予芒果苷苷元或芒果苷不会引起细胞凋亡的改变。4Gy单纯照射组的早期凋亡率为21.42％，给予芒果苷苷元组凋亡率为7.54％，给予芒果苷组凋亡率为9.35％。照射前给予HIEC细胞芒果苷苷元或芒果苷，可显著减轻细胞凋亡率，与单纯照射组相比差异具有统计学意义（P0.05）。 3、芒果苷苷元对斑马鱼的辐射防护效应 3.1对不同辐射剂量下不同发育时期斑马鱼胚胎存活率的影响：随着照射剂量的增加（10Gy、20Gy、30Gy），胚胎存活率降低，具有一定的剂量-效应关系。显微注射法给斑马鱼胚胎注射一定浓度的芒果苷苷元或芒果苷，作用一段时间后给予30Gy的γ射线照射。结果显示：芒果苷苷元和芒果苷可以减轻γ射线对斑马鱼胚胎的致死作用。与单纯照射组相比，照射前给予芒果苷苷元和芒果苷可显著（P0.05）提高斑马鱼胚胎的存活率。 3.2对一定辐射剂量下斑马鱼胚胎孵化率和畸变率的影响：与单纯照组相比，以芒果苷苷元组照射后的孵化率上升最明显(P0.05)。γ射线照射原肠期胚胎，可造成成年斑马鱼的畸型，芒果苷苷元组畸形发生率比单纯照射组明显减少；本实验中仅给予芒果苷苷元或芒果苷70μg/mL的胚胎孵化率下降并不明显，但与空白对照组相比较，各组幼鱼都出现一定的发育延迟现象。 3.3对一定辐射剂量下斑马鱼组织器官形态的影响：①肠道：单纯照射组斑马鱼切片HE染色显示，可看到小肠上皮细胞排列不规则，伴有不同程度的变性脱落，纹状缘消失，部分斑马鱼肠管粘膜杯状上皮细胞增生。照射前饲喂芒果苷苷元或芒果苷组小肠病理变化都比单纯照射组轻，特别是小肠隐窝仍保持原有形态，隐窝上皮细胞数量恢复。②肝脏：经30Gy的γ射线照射后，斑马鱼的部分肝细胞出现肿胀，可见少量炎性细胞浸润，胞浆内出现小泡性脂滴。严重时，表现为细胞核固缩、细胞破裂和溶解，细胞功能发生衰退和坏死。照射前饲喂芒果苷苷元和芒果苷，均可减轻辐射对斑马鱼肝脏的损伤。③肾脏：对照组斑马鱼肾脏结构完整，肾小球、肾小管清晰可见。经30Gy的γ射线照射后，斑马鱼肾小管上皮细胞出现肿胀、细胞境界不清，部分斑马鱼肾小管上皮细胞空泡样变和脂滴，肾间质瘀血并可见灶性炎细胞浸润。照射前饲喂芒果苷苷元和芒果苷，均可减轻辐射对斑马鱼肾脏的损伤。 4、芒果苷类化合物辐射防护作用机制探讨 4.1芒果苷苷元清除羟自由基(·OH)的能力：单纯照射组可以观察到很强的HPF荧光，而在照射前于体系中加入2μg/mL芒果苷苷元即可使HPF荧光明显减弱。定量分析时发现，与单纯照射组相比，不同浓度的芒果苷苷元或芒果苷·OH含量均有明显降低，差异具有统计学义（P0.05）；而且随药物浓度增加（1~10μg/mL），·OH含量逐渐下降，呈一定的剂量-反应关系。芒果苷苷元浓度为7μg/mL时，·OH含量下降最为明显，芒果苷各浓度下降与苷元类似，差异无统计学意义（P0.05）。 4.2芒果苷苷元对辐射引起的DNA双链断裂的影响：免疫荧光实验结果表明，人肠上皮细胞照射后0.5h的γ H2AX焦点（foci）个数随吸收剂量的增加（0~4Gy）而明显增多，呈一定的剂量-效应关系。一定剂量照射前给予细胞芒果苷苷元70μ g/mL共同孵育，单个细胞内foci数目明显减少，与单纯照射1、2、4Gy组相比，分别减少41.3%、46.8%和43.4%，芒果苷组分别减少36.2%、40%和37.5%。仅给予HIEC芒果苷苷元或芒果苷孵育，并未改变细胞核内DSBs的数目，与空白对照组相比，无统计学意义（P0.05）。于照射后不同时间点检测foci形成，照后0.5h~2h内foci数目达峰值后迅速下降，在此时间段内，芒果苷苷元组和芒果苷组的foci数目明显减少；而照后4~8h，给药组的foci数目与单纯照射组相似，无明显差异（P0.05）。讨论分析：辐射损伤防治一直是生物学与医学面临的难题，世界很多国家已投入巨资开展辐射防护药物的研究。但迄今为止，仅一种辐射防护药物，即WR2721被美国FBA批准进入临床，作为预防性保护措施在放疗中应用，但是其毒副作用较大[10]，作为预防用药很难被普通民众接受。因此，寻求新的辐射防护剂以应用于临床放疗或防治电离辐射损伤具有重要意义。辐射造成机体的损伤是通过直接作用和间接作用两种基本方式实现的，又以间接作用起着主要作用，也是辐射防护研究的重点。在辐射产生的间接作用中，辐射诱导的自由基又是最主要的关键因素，它们引发包括氧化损伤在内的一系列生物化学反应，导致细胞功能改变和结构破坏。所以清除辐射产生的自由基，削弱辐射的间接作用，达到减轻机体辐射损伤的目的，是辐射防护研究最常见的、且被众多实验证明是行之有效的切入途径。芒果苷结构中的酚羟基和芳香共轭基团的存在，使得它具有很好的清除羟自由基的能力[11]；另外，它还可以减轻自由基引发的细胞死亡，抑制线粒体功能异常的发生，修复SOD酶的活性[12~13]。芒果苷的抗氧化能力提示它可能具有很好的辐射防护效果[3~4],本课题研究证实了芒果苷的辐射防护作用。然而，芒果苷本身难溶于水，这很大程度上影响了它在辐射防护中的应用发展。通过对芒果苷母体结构的化学修饰，合成一系列新的衍生物，有可能解决芒果苷难溶于水的问题，而且还可能得到抗氧化能力更好的化合物。本课题在细胞水平上对不同芒果苷衍生物的防护作用进行研究，结果显示，在被筛选的25个芒果苷衍生物中，许多衍生物均有不同程度的防护作用，其中芒果苷苷元的辐射防护效果最佳。利用斑马鱼作为整体动物模型进一步研究发现，芒果苷苷元可以显著减轻γ射线对斑马鱼胚胎的致死作用，胚胎发育为成年时的畸形发生率比单纯照射组明显减少，孵化率明显上升；成年斑马鱼照射前应用芒果苷苷元后，肠道、肝脏和肾脏组织器官形态的辐射损伤显著减轻。这些结果充分表明，芒果苷苷元不仅保留了芒果苷具有辐射防护作用的活性，而且对细胞和整体动物的保护作用更全面。更重要的是，芒果苷苷元由于自身分子较小，具有较好的水溶性，更有研究发展前景。芒果苷苷元的辐射防护作用，与其清除羟自由基(·OH)和保护DAN有关。本研究表明，，在1~10μg/mL浓度范围内，随着芒果苷苷元药物浓度的增加，体系中·OH含量逐渐下降，呈一定的剂量-反应关系，以芒果苷苷元浓度为7μg/mL时·OH含量下降最为明显。研究还表明，芒果苷苷元能减轻辐射引起的DNA双链断裂，一定剂量照射前给予人肠上皮细胞芒果苷苷元70μg/mL共同孵育，单个细胞内反映DNA双链断裂（DBS）情况的γH2AX foci数目明显减少，与单纯照射1、2、4Gy组相比，分别减少41.3%、46.8%和43.4%。本实验还显示，芒果苷也具有清除·OH和减少受照细胞γH2AX foci的活性，但作用程度略弱于芒果苷苷元。众所周知，·OH是电离辐射诱导的对机体危害最大的自由基之一，而DNA分子则对电离辐射最敏感的生物大分子，DNA在电离辐射作用下形成的DBS，往往是细胞死亡或修复障碍的关键事件。我们认为，芒果苷苷元的辐射防护作用，在较大程度上是通过其清除·OH和减少DNA双链断裂途径实现的。综上所述，本课题重点围绕芒果苷苷元的辐射损伤防治作用进行探索，实验表明照前给予芒果苷苷元可以减轻辐射对人肠上皮细胞和斑马鱼胚胎及组织的损伤，显示了较好的对辐射损伤的治疗作用。并且已有文献报道芒果苷可用于临床[14]，结果显示它无明显的急性毒性，这与本实验结果相吻合：我们对芒果苷苷元和芒果苷的毒性进行初步分析，结果显示它们均无明显的急性毒性。因此，芒果苷及其衍生物在辐射损伤临床治疗应用方面具有很好的发展前景，芒果苷苷元则是一个新的潜在的辐射防护剂。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R285;R142

【参考文献】