多酚氧化酶交联对花生过敏原蛋白Ara h 2致敏性的影响研究

发布时间：2019-01-08 07:23

【摘要】：花生是一种高脂肪、高蛋白的食物,营养丰富,同时花生也是一种重要的过敏食物,由花生引发的过敏反应因其症状严重、发病机率高和死亡人数多的因素而受到全世界的广泛关注。Ara h2是花生过敏原中致敏性最强的蛋白,能被90%以上的过敏患者血清的IgE识别。Ara h2,作为花生中最主要的过敏原之一,研究并降低其致敏性具有重要意义。本论文研究工作先从花生中分离纯化Ara h2,从双孢蘑菇中制备多酚氧化酶粗酶液,确定了多酚氧化酶催化交联花生Ara h2蛋白的最佳条件,再对Arah2及其交联产物模拟人体胃肠消化,研究其消化性和致敏性的变化,同时对其显微结构进行了研究分析,本研究内容包括以下几个方面： 1.登入SWISS-MODEL网站,以与Ara h2同源性高达59%的Ara h6为模版,同源建模,构建的Ara h2.01和Ara h2.02的模型都只有一个。通过软件对其过敏原表位和交联位点分析发现,Ara h2.01的交联位点可能有3个,Ara h2.02交联位点可能有4个；而且这些交联位点大部分位于Ara h2的三个主要过敏原表位中的aa60-69、aa70-75之间,因此这些位点上的蛋白交联可能对Ara h2的致敏性影响显著。 2.优化了离子交换柱层析色谱柱一步法纯化Ara h2的方法,优化条件主要包括降低了梯度洗脱盐离子浓度、降低了缓冲液pH和选取第二次浸提的粗蛋白,考马斯亮蓝染色后,灰度扫描结果显示其纯度大于90%,离子交换层析纯化得率为23.31%,重现性好。制备了酶活达到6000U/mL的多酚氧化酶酶液,可用于后续的Arah2交联实验。 3.确定了多酚氧化酶催化交联花生过敏原Ara h2的加工条件。多酚氧化酶催化交联Ara h2的最适体系为：Ara h2的浓度为1mg/mL,多酚氧化酶酶活终浓度1600U/mL,酶促反应条件：50℃,pH7.0,反应80分钟,研究结果还显示离子强度对多酚氧化酶交联Ara h2无显著差异,温度和酶活对交联反应影响显著。阐明了不同还原剂对多酚氧化酶催化交联Ara h2的作用,发现高浓度的β-巯基乙醇几乎能完全抑制酶交联反应的发生,且通过改变其浓度可控制交联反应的程度。 4.系统地评价了花生Ara h2及其交联产物的消化性,同时运用显微学手段观察了Ara h2、Ara h2交联产物以及模拟胃肠消化后产物的显微结构,研究发现,Ara h2蛋白抗胃消化但易被肠消化,而Ara h2交联产物相对可被胃消化,由于形成高聚物使得其肠消化速率比Ara h2有所减慢。显微研究结果表明,天然的Ara h2蛋白具有容易聚集的特性,其平均粒径为287nm,交联形成的高聚物平均粒径则为1705nm；模拟胃肠消化后的电镜结果也和激光粒度仪检测结果相吻合,Ara h2经过胃消化后,观察到了粒径小于287nm且大小不均一的颗粒蛋白存在。交联产物胃消化后,观测到了残留Ara h2蛋白；交联产物模拟肠消化后,也观察到了Ara h2和未被完全消化高聚物。 5.采用间接竞争ELISA法对花生Ara h2、Ara h2交联产物抗原性和间接ELISA法对Ara h2、Ara h2交联产物的致敏性进行了评估,结果表明,与Ara h2相比,Ara h2交联产物在低浓度(0.32μ g/mL)时,Ara h2的抗原性强于Ara h2交联产物的,而在高浓度(≥0.32μ g/mL)时,由于蛋白聚集使得Ara h2的抗原性降低,从而导致Ara h2交联产物的抗原性高于Ara h2,但是两者并无显著性差异。而对Ara h2、Ara h2交联产物IgE结合能力实验结果显示,经过交联后,Ara h2蛋白的致敏性显著降低；对于Ara h2及其交联产物模拟胃消化后,IgE结合能力最强的是Ara h2, Ara h2交联产物次之,最弱的是胃消化后的Ara h2, Ara h2及其交联产物模拟肠消化后,IgE结合能力最强的仍然是Ara h2,肠消化后的Ara h2次之,最弱的是Ara h2交联产物。最后研究表明,0.5%的β-巯基乙醇为是控制交联的临界点,此时的致敏性也最低。
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【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R155;Q946.1

【参考文献】