4-壬基酚暴露所致雄性生殖毒性及机制研究

发布时间：2019-01-08 09:19

【摘要】：第一部分4-壬基酚对雄性大鼠的生殖毒性及凋亡机制研究目的：4-壬基酚(4-nonylphenol, NP)为一种典型的环境内分泌干扰物,具有模拟机体雌激素样活性,NP所诱导的雄性生殖毒性效应及其毒作用分子机制,是生殖毒理学领域界的研究热点之一。睾丸组织细胞增殖与凋亡的动态平衡维持着睾丸正常结构、功能及其内环境的稳定。本课题旨在研究NP暴露对成年大鼠附睾精子参数和睾丸组织学的影响,同时,以成年期和青春期SD大鼠为受试对象,以睾丸组织细胞的增殖-凋亡情况为研究主线索,从线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径的角度,来探索NP致雄性生殖毒性的潜在发生机制。方法：将24只50日龄处于成年期的雄性SD大鼠,随机分成四组(每组6只)：0、25、50和100mg/kgNP组,每两天注射一次,连续染毒20天：将24只35日龄处于青春期的雄性SD大鼠,随机分成四组(每组6只)：0、5、20和60mg/kgNP组,每两天腹腔注射一次,连续30天；采用计算机辅助精液分析系统(CASA)分析大鼠附睾中精子各类参数；ELESA法测定血清FSH、LH、T水平和睾丸组织果糖含量；比色法检测血清、睾丸组织SOD、GSH-Px活性及MDA含量；HE染色观察大鼠睾丸组织形态结构的改变；荧光TUNEL法检测大鼠睾丸组织细胞凋亡；免疫荧光法检测大鼠睾丸组织Ki-67增殖指数；DHE荧光探针染色法观察大鼠睾丸组织ROS水平：利用酶标仪定量检测大鼠睾丸组织超氧阴离子自由基(O2一)和过氧化氢(H2Oz)含量;透射电镜法观察睾丸组织内细胞超微结构的改变,RT-PCR和Western blot方法检测睾丸组织目的基因和蛋白的表达。结果：100mg/kg NP组与对照组比较,50日龄大鼠附睾精子VCL、VAP和AB级精子数量组间差异显著；与对照组比较,100mg/kg NP组附睾精子畸形率明显增加,且该组睾丸组织精曲小管退化明显；100mg/kg NP组血清FSH和LH显著降低；50mg/kg NP组和100mg/kg NP组的血清T和睾丸组织果糖含量,均显著降低；50mg/kg NP组和100 mg/kg NP组睾丸组织ROS含量、O2·-和H202含量均显著增加；50mg/kg NP组和100 mg/kg NP组血清和睾丸组织SOD及GSH-Px活性均显著降低、MDA含量明显增加；100 mg/kg NP组睾丸组织抗氧化基因SOD1、CAT、GPx和CYP1B1的mRNA表达显著降低：100 mg/kg NP组睾丸组织精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、睾丸支持细胞(Sertoli cells, SCs)和睾丸间质细胞(Leydig cells)的细胞内结构有明显改变,100 mg/kg NP组睾丸组织的细胞增殖指数明显降低,细胞凋亡指数目明显增加。Western blot结果显示,与对照组比较,50日龄50mg/kg NP组和100 mg/kg NP组睾丸组织的Bcl-2蛋白表达下调；Bax、Fas、FasL和p53蛋白表达上调；35日龄20 mg/kg NP组和60 mg/kg NP组睾丸组织Bcl-2蛋白表达明显;Bax、Apaf-1、Cytochrome c、Cleaved-caspase-3、Fas、 FasL和p53蛋白表达上调。结论：NP暴露可诱导SD大鼠机体和睾丸组织处于氧化应激状态,引起睾丸组织细胞增殖-凋亡失衡,干扰机体生殖激素合成和睾丸组织能量代谢,这些都可能是NP诱导睾丸生精细胞异常和精子质量降低的作用机制。同时NP暴露后所激活的线粒体通路和死亡受体通路,很可能参与NP致睾丸组织细胞凋亡的过程。第二部分4-壬基酚致睾丸支持细胞凋亡、自噬和坏死及其分子机制研究目的：Akt、AMPK、JNK和mTOR信号在生物机体内,广泛参与调节细胞生长、增殖、分化、凋亡和自噬等生理及病理过程。睾丸支持细胞(Sertoli cell, SC)是生精小管内,唯一直接与生精细胞接触的体细胞,其结构和功能的完整性对生精细胞的增殖和成熟有重要的作用,同时,SC为精子发生提供适宜的微环境。本课题旨在研究NP暴露对原代大鼠SCs的影响；以Akt、AMPK、JNK和mTOR信号为切入点,对NP毒作用机制开展相关的探索性研究。方法：采用不同终浓度的NP(5-60μM)染毒离体培养的SCs后,应用CCK-8法检测SCs细胞活力；JC-1荧光探针检测SCs细胞线粒体膜电位的改变；透射电镜观察SCs细胞超微结构的改变：流式细胞术检测SCs细胞凋亡分布、细胞增殖周期变化和细胞内ROS含量；MDC荧光染色标记SCs细胞内自噬囊泡;DCFH-DA荧光探针测定SCs细胞内ROS水平；细胞免疫荧光法观察SCs细胞内目的蛋白的表达情况;ROS抑制剂NAC、自噬抑制剂3-MA分别对SCs的预处理,进而暴露于NP,观察细胞凋亡和细胞自噬的发生情况；RT-PCR和Western blot方法检测SCs目的基因和蛋白的表达。结果：与对照组比较,≥20μM NP染毒SCs 24 h后其细胞活力显著降低；20 μM和30μM NP诱导细胞G2/M期周期阻滞、细胞线粒体膜电位降低、细胞内ROS蓄积；导致细胞凋亡和坏死；促发细胞发生细胞自噬；同时,SCs抗凋亡蛋白Bcl-2和Mci-1的蛋白表达降低,促凋亡蛋白Bax、Bad和Bim的蛋白表达表达增加,Cytochrome c、Apaf-1和Cleaved-caspase-3蛋白高表达,细胞周期调控蛋白P21、P27、Cyclin D1、Cyclin A和Cyclin B1表达异常,MDC标记的阳性细胞数显著的增加,自噬标志性蛋白Beclin-Ⅰ蛋白表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达比值显著增加；此外,20 μM和30μM NP分别染毒SCs6 h、12 h和24 h后,2p-AMPK/AMPK和Thr183/185 p-JNK/JNK蛋白表达均上调,Bax、 Cleaved-caspase-3、Cytochrome c和Beclin-1蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达比值亦上调,Ser473p-Akt/Akt、Thr1462p-TSC2/TSC2、Ser2448p-mTOR/mTOR、Thr389p-p70S6K/p70S6K和Thr37/45p-4EBP1/4EBP1蛋白表达比值显著降低；ROS抑制剂NAC预处理SCs后,可有效的抑制NP致细胞内ROS过量产生,与此同时,NP致SCs发生细胞自噬、凋亡和坏死的能力被有效地抑制,此外,NP所诱导的AMPK、Akt、JNK和mTOR/p70S6K/4EBP1信号的异常改变亦被有效地逆转。自噬抑制剂3-MA对SCs的预处理,可抑制NP促细胞白噬的能力,与此同时,NP促细胞凋亡和坏死的能力进一步增强,此外,NP所诱导的AMPK、JNK和mTOR/p70S6K/4EBP1信号异常改变亦被逆转。结论：NP对SCs具有细胞毒性；NP诱导细胞产生的过量ROS很可能是导致细胞发生自噬、凋亡和坏死的上游信号分子；NP暴露促发细胞自噬发生这一过程很可能是SCs在接受外界环境的刺激或处于氧化应激状态时的一种自我保护机制;ROS-Akt信号很可能参与NP致SCs发生细胞凋亡的过程；ROS-JNK信号和ROS-AMPK-mTOR信号通路很可能参与NP致SCs发生细胞自噬的过程。第三部分4-壬基酚诱导睾丸支持细胞发生自噬及其AMPK-mTOR信号调控机制目的：本课题拟通过体内研究,观察NP染毒SD成年大鼠后,其睾丸组织SCs是否发生细胞自噬。同时,结合体内和体外研究,以AMPK-mTOR信号通路为研究主线,研究AMPK-mTOR信号是否参与调控SCs细胞自噬发生的过程,并验证AMPK信号介导mTOR/p70S6K/4EBP1信号级联反应。方法：将24只处于成年期(50日龄)雄性SD大鼠随机分成四组(每组6只)：对照组及25、50和100mg/kg三个NP染毒组；体外培养原代SCs,根据是否暴露于NP分为对照组和NP染毒组(10、20和30 μM)：采用AMPK特异性抑制剂Compound C、AMPK特异性激动剂AICAR和AMPK siRNA分别与NP联用处理SCs; CCK-8法检测细胞活力;透射电镜观察睾丸组织SCs自噬发生的情况；细胞免疫荧光法观察细胞内目的蛋白的表达情况；RT-PCR和Western blot方法检测目的基因和蛋白的表达。结果：50、100mg/kg NP染毒大鼠后,可促发其睾丸组织SCs自噬的发生：与对照组比较,50、100 mg/kg NP染毒组睾丸组织Beclin-1、Atg 3、Atg 5、Atg 7和Atg 12 mRNA表达显著增加,同时,睾丸组织Beclin-1蛋白表达和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表达比值亦显著增加；25、50、100 mg/kg NP染毒组与对照组比较,睾丸组织LKB1、AMPK、TSC2、 TSC1、Rheb、mTOR、4EBP1、S6K和p70S6K mRNA表达组间差异显著;与对照组比较,50、100 mg/kg NP染毒组睾丸组织Thr172p-AMPKa/AMPKa蛋白表达比值均上调,同时,Thr1462p-TSC2/TSC2、Ser2448p-mTOR/mTOR、Thr389p-p70S6K/p70S6K和Thr37/45p-4EBP1/4EBP1蛋白表达比值均下调；体内研究结果基本与体外研究结果一致。Compound C和AMPK siRNA分别与NP联合处理SCs,可有效地抑制NP促细胞自噬的能力,与此同时,也有效地逆转了NP所诱导的TSC2/mTOR/p70S6K/4EBP1信号通路关键蛋白的异常表达。AICAR与NP联合处理SCs,可加剧NP诱导细胞自噬的发生,与此同时,进一步促进NP下调Ser2448p-mTOR/mTOR蛋白表达比值,但对p70S6K/4EBP1信号表达无明显影响。结论：NP具有诱导SCs细胞自噬的能力；AMPK-mTOR信号通路很可能参与调控NP致SCs自噬发生过程；AMPK介导的mTOR-p70S6K/4EBP1信号很可能是NP致睾丸发育异常及睾丸细胞毒性作用的可能机制。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
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本文编号：2404406