双酚A对小鼠胚胎干细胞分化潜能的影响及其机制探讨
发布时间:2019-02-21 14:23
【摘要】:双酚A(bisphenol A,BPA)广泛存在于人类生存环境中,与人的各种生产、生活活动密切相关,人体普遍暴露于双酚A中,尤其是孕妇的暴露日益受到关注。经典的毒理学研究指出一定剂量的BPA可能抑制胚胎发育。19世纪末以前,因受实验技术手段和医学伦理学方面的限制,难以开展早期胚胎发育宫内研究,这使人们对BPA对胎儿早期发育的影响及其机制知之甚少,且主要停留在动物实验阶段。20世纪末以来,胚胎干细胞理论和技术及其应用的快速发展,为外源化学物的毒性研究提供了新的手段。本研究选用双酚A作用于小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)并开展系列相关的体外实验,在细胞水平评价双酚A的胚胎毒性,为合理评价BPA的安全性提供科学依据;同时观察BPA是否可以通过改变部分基因启动子区甲基化水平进而影响特定基因的表达,为进一步研究BPA的早期胚胎发育影响及其机制提供新思路。 目的:1、通过体外饲养层支持培养S6系小鼠胚胎干细胞,应用胚胎干细胞实验方法(EST)评价BPA的胚胎毒性,同时观察不同浓度BPA对拟胚体生长分化的影响,为合理评价BPA的安全性及探索双酚A对小鼠胚胎干细胞分化潜能的影响提供依据。2、mES细胞采用条件培养基培养,观察不同浓度BPA对其细胞毒性及OCT4、SOX2及Nanog基因表达水平的影响,同时检测BPA对mES细胞OCT4基因启动子区DNA甲基化情况,为进一步研究BPA的早期胚胎发育影响及其机制提供科学依据。 方法:1、采用饲养层支持培养mES细胞,设置溶剂对照(DMSO)、BPA(10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L、10~(-4)mol/L、10~(-3)mol/L,所用BPA浓度涵盖了环境相关浓度和较高浓度对照)。利用悬滴、悬浮培养方法,通过对不同浓度BPA作用下,mES细胞体外分化为心肌细胞能力的检测,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,结合相应CCK-8法检测BPA对mES细胞及小鼠胚胎成纤维细胞3T3的半数抑制浓度(IC50),通过分化抑制试验得到双酚A对小鼠胚胎干细胞的50%分化抑制浓度(ID50),再根据判别公式评价双酚A的胚胎毒性,并筛选合适的浓度用于后期分化诱导。2、结合ES细胞半数分化抑制浓度和相关文献,设置溶剂对照(DMSO)、BPA(10-9mol/L、10~(-8)mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L)和E210-9mol/L雌二醇对照组。将mES细胞通过悬滴、悬浮培养方法获得拟胚体(EB),并在不添加任何诱导因子的体系中连续培养EB至10d,实时荧光定量PCR(RT-Q-PCR)法检测内胚层特征性基因(Transthyretin、AFP)、中胚层特征性基因(Flk-1、Gata-1)、外胚层特征性基因(Vimentin、Nestin)在EB中的mRNA表达情况,观察双酚A对拟胚体生长分化的影响。3、设置溶剂对照(DMSO)、BPA(1.56×10~(-5)mol/L、3.12×10~(-5)mol/L、6.25×10~(-5)mol/L、1.25×10~(-4)mol/L、2.5×10~(-4)mol/L、5×10~(-4)mol/L、1×10~(-3)mol/L、2×10~(-3)mol/L等8个浓度组,染毒mES细胞24h后,CCK~(-8)法检测BPA对细胞增殖的影响,计算半数抑制浓度(IC_(50))。然后选择mES细胞暴露不同浓度BPA(0、10~(-8)mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L、10~(-4)mol/L)24h,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测双酚A作用下OCT4、SOX2在mRNA和蛋白水平表达的变化。4、结合碱基特异性酶切反应与MALDI-TOF-MS检测原理,运用Sequenom公司的MassARRAY检测系统,检测OCT4基因启动子区DNA甲基化情况。 结果:1、按照胚胎干细胞实验方法,得到其三个反应终点IC_(50)ES、IC_(50)3T3、ID50分别为:5.22×10~(-4)mol/L,6.25×10~(-4)mol/L、7×10~(-7)mol/L,同时将三者带入到预测模型的三个线性判别函数中,根据模型判断标准,判断BPA属于强胚胎毒性化合物。2、在一定浓度范围内,BPA对内胚层特征性基因(Transthyretin、AFP)及外胚层特征性基因(Vimentin、Nestin)的影响不明显(P>0.05);而对中胚层特征性基因(Flk-1、Gata-1)影响,表现为先升高后降低的趋势,在较低浓度组10-9mol/L及10~(-8)mol/L升高(P0.05),在较高浓度组和阳性对照组降低。3、BPA对mESC有一定的毒性作用,染毒浓度越大,细胞活性越小,二者呈剂量-效应关系,并通过计算得出BPA对mESC的IC_(50)为4.3×10~(-4)mol/L,同时结合BPA的环境相关暴露浓度和相关资料,最终取10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)、10~(-4)mol/L五个浓度作为后续实验浓度;BPA处理24h后,mESC细胞形态发生改变,较高浓度组与对照组比较,细胞数量明显减少,出现少许漂浮的细胞,克隆变得不规则,分化趋势明显。BPA浓度为10~(-7)mol/L组、10~(-6)mol/L组、10~(-5)mol/L组、10~(-4)mol/L组的OCT4mRNA相对表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P值均0.05);BPA浓度为10~(-4)mol/L组的SOX2mRNA相对表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P值0.05);BPA浓度为10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L、10~(-4)mol/L浓度组Nanog的mRNA表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。BPA浓度为10~(-5)mol/L组、10~(-4)mol/L组的OCT4蛋白质相对表达水平均高于DMSO组,差异有统计学意义(P值均0.05);而各浓度组SOX2蛋白相对表达水平均未发现明显改变;而Nanog蛋白相对表达水平呈先升高后下降的趋势,在10~(-7)mol/L达到最高,而在10~(-4)mol/L达到最低,差异有统计学意义(P 0.05)。4、经SssI甲基转移酶处理的DNA样品, CpG甲基化程度明显高于其他任何一组的DNA样品,差异有统计学意义(P0.05),提示该检测方法的灵敏度良好。与溶剂对照组比较,DAC和TSA处理组OCT4基因CpG甲基化率明显降低,差异有统计学意义(P0.05);与溶剂对照组比较,BPA处理组CpG甲基化率,随着染毒剂量的升高有下降的趋势,,但变化不是很明显,仅在10~(-5)mol/L浓度组下降较为明显,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1、成功分离培养了C57/BL6系小鼠来源的小鼠胚胎成纤维细胞,并可进行7代以内的传代培养,成功对mES细胞进行培养。初步建立小鼠EST体系,并利用该体系对BPA的胚胎毒性进行分类,判断BPA属于强胚胎毒性化合物。2、成功将mES细胞分化成拟胚体,在一定浓度范围内,随着BPA染毒浓度的升高,拟胚体中胚层特征性基因表达呈现先升高后降低的趋势,提示在较低浓度范围内的BPA对mES细胞的分化潜能有影响,尤其对分化为中胚层细胞影响较大,促进其向中胚层分化。3、BPA在一定浓度范围内可增强OCT4基因的表达,对SOX2基因表达无明显影响,而在一定程度上降低Nanog基因的表达,提示OCT4、SOX2及Nanog基因协调合作,共同维持维持ES细胞多潜能性和自我更新能力及早期胚胎发育。4、BPA作用于mES细胞过程中,OCT4基因启动子区呈现低甲基化状态,且其甲基化情况在低浓度时变化不明显,只有在较高浓度时甲基化率降低。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R114
本文编号:2427583
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【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R114
【参考文献】
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1 裴新荣,李勇,龙鼎新,陈星,高丽芳,陈祥贵;双酚A对小鼠早期胚胎发育毒性的体外实验研究[J];中国生育健康杂志;2003年01期
2 于洲;严卫星;张连峰;徐海滨;;应用胚胎干细胞实验模型对人参皂甙Rb1、Rg1发育毒性的初步研究[J];毒理学杂志;2008年03期
3 于洲;严卫星;张连峰;徐海滨;;胚胎干细胞实验模型在发育毒性评价中有效性的初步研究[J];卫生研究;2008年05期
本文编号:2427583
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