【摘要】：目的本研究通过观察不同浓度和时间的氟处理对体外培养的原代海马神经元突触形态、超微结构的影响,检测突触可塑性相关分子的基因和蛋白表达水平,明确氟暴露对海马神经元突触结构可塑性影响。方法取新生24h内的SPF级SD大鼠的海马组织,经消化后进行体外培养。培养7天后将海马神经元分别暴露在含有终浓度为0.0(对照)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/L氟化钠的培养基中,置入含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养6h、12h、24h。光学倒置显微镜及透射电子显微镜下观察氟处理后海马神经元突触及其胞体的形态变化;CCK8测定氟处理后海马神经元细胞存活率;一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)试剂盒测定细胞培养上清液中NOS活力和NO含量;流式细胞仪测定细胞中钙离子水平;RT-PCR法测定细胞中突触相关蛋白突触素(SYN)、生长相关蛋白43(GAP-43)、突触后致密蛋白95(PSD-95)的m RNA表达水平;Western-blot法测定细胞中磷酸化钙调蛋白激酶Ⅱ(p Ca MKⅡ)、SYN、GAP-43、PSD-95蛋白的表达水平。结果1随着氟处理浓度增加,具有丰富型神经网络细胞的个数减少,而具有非丰富型神经网络细胞的个数增加。电镜下可观察到氟处理6h的海马神经元线粒体有明显的空泡化,且随着氟处理剂量的增加线粒体空泡现象愈明显。2细胞存活率在不同浓度氟处理组间有统计学差异(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L各组细胞的存活率低于对照组和低剂量(0.1、0.2mg/L)组(P0.05);细胞存活率在不同时间氟处理组间有统计学意义(P0.05),0.4、0.8和1.6mg/L各组氟处理24h的细胞存活率显著低于6h(P0.05),处理时间和处理剂量对细胞存活率的影响存在交互作用(P0.05)。3细胞内钙离子水平及p Ca MKⅡ蛋白表达水平在不同浓度氟处理组间有统计学差异(P0.05),0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L各组细胞内钙离子水平及p Ca MKⅡ蛋白表达水平显著高于对照组(P0.05),随着氟处理剂量增加细胞内钙离子水平及p Ca MKⅡ蛋白表达水平呈升高趋势;细胞内钙离子水平及p Ca MKⅡ蛋白表达水平在不同时间氟处理组间有统计学差异(P0.05),0.2、0.4、0.8、1.6mg/L氟处理24h各组钙离子水平显著高于6h和12h的表达水平(P0.05),氟处理12h和24h的p Ca MKⅡ蛋白表达水平显著高于6h的表达水平(P0.05)。氟处理时间和剂量对钙离子水平及p Ca MKⅡ蛋白表达水平的影响存在交互作用(P0.05)。4培养上清液中NOS活力及NO含量在不同浓度氟处理组间有统计学差异(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L氟处理各组NOS活力及NO含量显著高于对照组和低剂量(0.1、0.2mg/L)组(P0.05);培养上清液中NOS活力及NO含量在不同时间氟处理组间有统计学差异(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L氟处理24h各组NOS活力及NO含量显著高于6h的表达水平(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L氟处理24h各组NO含量显著高于12h(P0.05)。氟处理时间和剂量对NOS活力及NO含量的影响存在交互作用(P0.05)。5 SYN、GAP-43、PSD-95 m RNA表达水平在不同浓度氟处理组间有统计学差异(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L氟处理各组细胞内SYN、GAP-43、PSD-95 m RNA表达水平显著低于对照组和低剂量(0.1、0.2mg/L)组(P0.05),呈降低趋势;SYN、GAP-43、PSD-95 m RNA表达水平在不同时间氟处理组间有统计学差异(P0.05)。0.4、0.8、1.6mg/L氟处理24h各组SYN、GAP-43、PSD-95 m RNA表达水平显著低于氟处理6h和12h各组的表达水平(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L氟处理12h的GAP-43 m RNA表达水平显著低于6h(P0.05)。氟处理时间和剂量对SYN、GAP-43、PSD-95 m RNA表达水平的影响存在交互作用(P0.05)。6 SYN、GAP-43、PSD-95蛋白表达水平在不同浓度氟处理组间有统计学差异(P0.05),0.4、0.8、1.6 mg/L氟处理各组细胞内SYN、GAP-43、PSD-95蛋白表达水平显著高于对照组和低剂量(0.1、0.2mg/L)组(P0.05),呈降低趋势;SYN、GAP-43、PSD-95蛋白表达水平在不同时间氟处理组间有统计学差异(P0.05),0.4、0.8、1.6mg/L氟处理24h的SYN,GAP-43和PSD-95蛋白水平显著低于6h和12h(P0.05)。结论1氟降低体外培养的海马神经元存活率和具有丰富型神经网络细胞的构成比;氟处理损伤海马神经元的线粒体结构。2氟使体外培养的海马神经元钙超载,p Ca MKⅡ蛋白表达水平升高;氟增强NOS的活力,升高NO水平,造成海马神经元损伤;通过降低SYN、GAP-43、PSD-95 m RNA和蛋白的表达水平而损伤其突触结构可塑性。3氟处理浓度和时间均能对海马神经元的突触结构可塑性造成损伤,且两者之间存在着交互作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R114
【参考文献】
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