铅诱导PC12细胞旁观者效应及细胞间隙连接通讯（GJIC）作用研究

发布时间：2019-05-31 00:36

【摘要】：研究背景铅是工业上常用的重金属之一,可以通过呼吸和消化系统进入人体。铅具有很强的神经毒性,可导致不可逆的神经系统损伤,儿童在发育期对铅暴露产生的毒性尤为敏感。科学家们发现即使儿童的血铅浓度保持在可接受水平,儿童的智力发育仍会受到明显影响。因此,铅的神经毒性受到了广泛关注。细胞生长的微环境是保持细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动的重要条件。细胞对外界的微环境非常敏感,在同一共培养体系中,细胞之间或细胞与胞外基质之间的直接接触可以影响细胞的生长状态。近几十年来,在放射生物学领域发现,当少数细胞受到射线照射时,没有受到射线直接照射的周围细胞也能表现出一些损伤效应。大量研究已经证明在体内和体外实验中确实存在损伤传递效应。例如,慢性粒细胞白血病患儿的脾部在接受放射线照射治疗时,胸骨骨髓细胞发生了损伤；局部氧化损伤可以通过GJIC在内皮细胞之间传递。有人提出用肿瘤自杀基因治疗肿瘤,当部分肿瘤细胞转染自杀基因后,在药物启动转染细胞自杀后,转染细胞及周围未转染细胞均被杀灭。近年来,有人发现局部氧化损伤可以通过细胞间缝隙连接通讯(GJIC)在上皮细胞间传递。以上所述存在着一个共同的现象,就是某些有害因素引起的靶细胞损伤不仅仅局限于靶细胞本身,还可以引起周围正常细胞产生损伤。暴露于有害因素的细胞群会h出现明显的生物效应,这种效应在暴露细胞群和周围未暴露细胞群都会发生,这一现象人们称之为旁观者效应(bystander effect,BE)。旁观者效应是指正常细胞在直接受到有害因素损害的靶细胞诱导下发生的诸如细胞死亡、基因突变、染色体不稳定等反应,这些经诱发而发生效应的正常细胞成为旁观者细胞。由于旁观者效应的存在,使靶细胞的损伤效应得以延续与放大,从而使损伤明显加重。这些研究提醒人们：机体对损伤的反应不仅仅是单个独立细胞或者组织,而是具有群体性。对于旁观者效应的发现已有几十年,但至今为止,旁观者效应的确切机制尚未阐明。越来越多研究表明,旁观者效应可能与缝隙连接蛋白(connexin, Cx)介导的细胞间隙连接通讯(gap-junctional intercellular communication, GJIC)有密切关系。缝隙连接蛋白是构成细胞间缝隙连接通道基本结构和功能的一类膜蛋白。由六个穿膜的缝隙连接蛋白组成中空的亲水性六聚体结构叫做连接小体(connexon)或缝隙连接半通道(gap junction hemichannel)。在正常情况下,细胞膜对应面上的一对连接小体组成了GJ通道,它能允许分子量低于1KD或直径小于1.5nm的小分子物质如代谢分子、离子、第二信使(如Ca2+、ATP)等通过,这些小分子参与细胞间物质交换的代谢藕联和电信号传递的电藕联,进行细胞间信息传递,从而在细胞的分化、生长、生理功能的调节中发挥重要作用。铅毒物可增加细胞内活性氧簇(ROS)的水平,同时减少抗氧化物质的浓度活性,破坏氧化、抗氧化平衡,导致氧化损伤,诱发细胞凋亡。同时铅还可通过影响一些相关基因的表达,影响细胞凋亡。目前铅诱导细胞凋亡机理的研究已经取得了许多进展,但尚不完善,铅中毒是否会发生旁观者效应未见报道,铅中毒的毒性代谢产物能否通过间隙连接细胞间通讯(GJIC)进行传导等问题仍有待于深入研究。综上所述,我们选择神经元模式细胞-大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PCl2)为研究对象,希望通过对染毒细胞与未染毒细胞共培养体系的研究,对醋酸铅诱导PC12细胞旁观者效应的过程有一个系统、完整的认识,同时为防治铅中毒的下一步研究提供依据。研究目的： 1、利用直接接触混合共培养技术,构建可以区分醋酸铅染毒与未染毒PC12细胞的共培养体系； 2、通过混合共培养体系,观察醋酸铅染毒PC12细胞对周边正常PC12细胞的影响； 3、研究缝隙连接蛋白介导的细胞间缝隙连接是否参与醋酸铅诱导的旁观者效应,旨在探讨醋酸铅诱导PC12细胞旁观者效应可能的毒理机制。研究方法： 1、确定醋酸铅的细胞毒性并筛选适合诱导PC12旁观者效应的醋酸铅浓度 (1)细胞增殖能力检测按照醋酸铅浓度将细胞分成5个实验组(0、0.01、0.1、1、10、100μM),通过MTT比色法,检测不同浓度醋酸铅对PC12细胞增殖能力的影响。分别以每孔5x103个细胞接种到96孔板,暴露于不同浓度的醋酸铅,每孔加MTI昒液20ul,继续培养24h后终止培养,弃培养上清液,每孔加150ul二甲基亚砜(DMSO),置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分融解,选择490nm波长,通过酶联免疫监测仪测定各孔光吸收值。 (2)ROS水平检测将PC12细胞分成2个实验组：PC12、PC12(10μM Pb处理)。各组细胞孵育24h融合后进行实验,弃培养液,室温下D-Hank's漂洗3次,加入含有10μMDHE荧光探针无血清DMEM培养液1mL,37℃避光孵育20min,用无血清培养液洗涤细胞3次,0.25%胰蛋白酶消化,加入1mL无血清培养液吹打均匀,染色完毕后进行Hoechst33342染色。通过荧光显微镜,观察细胞内ROS水平检测。激发波长480～535nm,最大发射波长590nm～610nm; Hoechst33342的最大激发波长为350nm,最大发射波长为460nm。 (3)凋亡相关蛋白检测按照醋酸铅浓度将细胞分成5个实验组(0、0.01、0.1、1、10、100μM),通过RT-PCR,检测凋亡相关基因(Bax, Bcl-2)的mRNA表达水平,以β-actin做内参照。根据NCBI所提供的基因序列,通过引物设计软件Primer3设计相应引物,扩增条件为预变性：94℃for5min;变性94℃30s,退火60℃30s,延伸72℃1mmin,30个循环；后延伸72℃5min。 (4)细胞凋亡检测按照醋酸铅浓度将细胞分成5个实验组(0,0.01,0.1,1,10,100μM),通过Annexin v-PE/7-AAD试剂盒,检测PC12细胞凋亡情况。收集1～5×105细胞；加入500μL的Binding Buffe悬浮细胞；加入1μL Annexin V-PE混匀；室温、避光、反应5～15min；加入5μL7-AAD染液,混匀；室温、避光、反应5-15min；在1h内完成流式细胞仪的检测。 (5)线粒体跨膜电位将细胞分成3个实验组：PC12、GFP-PC12、GFP-PC12(10μM Pb处理)将各组细胞培养24h后,分别加入20nM TMRM,通过流式细胞仪检测线粒体跨膜电位。 (6)NAC处理将细胞分成3个实验组：PC12、PC12+10μM Pb、PC12(NAC处理)+10μMPb,分别检测各组细胞ROS、线粒体膜电位、凋亡水平(方法同上)。 2、构建染毒细胞与正常细胞共培养体系,并观察检测醋酸铅诱导PC12旁观者效应 (1)构建EF1A-eGFP稳定转染PC12细胞株将处于对数生长期的PC12细胞吸去培养液,用PBS洗涤后加入适量Trypsin-EDTA,消化后移至离心管中,取1×105cells/9.6cm2的密度接种至六孔板,待细胞完全贴壁后,即可进行转导。转导前,每孔细胞换成1.5mL新鲜的HD+10%FBS培养基或1640+20%FBS培养基,每株各选取一孔细胞加入30μL的Lenti-eGFP/Neo,充分的摇匀后放入37℃、5%CO2、95%相对湿度的培养箱中培养。转导7小时后,吸去含有Lenti-eGFP/Neo的完全培养基,换成新鲜的HD+10%FBS培养基或1640+20%FBS培养基,放入37℃、5%CO2、95%相对湿度的培养箱中培养。转导48小时后,于荧光显微镜下观察转导效果。 (2)细胞混合培养荧光显微镜观测将PC12、GFP-PC12按比例混合培养,用PBS制备50μM Hoechst33342染料,在37℃培养细胞20分钟,用PBS冲洗细胞两次,用带有350nm激发波长,460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。 (3)共培养体系ROS水平、凋亡水平、线粒体跨膜电位检测：将细胞分成2个实验组组：GFP-PC12+PC12、GFP-PC12(10μMPb处理)+PC12。分别进行ROS水平、凋亡水平、线粒体跨膜电位检测(方法同上)。 3、GJIC在醋酸铅诱导PC12旁观者效应中的作用研究 (1)共培养体系缝隙连接功能检测将细胞分成2个实验组：GFP-PC12(10μMMPb处理)+PC12、GFP-PC12(10μMPb处理)+PC12+CBX;通过细胞接种荧光示踪法(Parachute Assay)检测细胞间荧光传递功能,即细胞GJ功能。 (2) GJIC阻断剂甘珀酸(CBX)对旁观者效应的影响将细胞分成2个实验组:GFP-PC12+PC12、GFP-PC12(10μMPb处理)+PC12、GFP-PC12(10μMPb处理)-PC12+CBX。分别进行ROS、凋亡、线粒体跨膜电位检测(方法同上)。 4、数据处理上述实验至少重复三次。各组间的检验如方差齐则采用单因素方差分析,两两比较采用LSD方法；如方差不齐则采用Welch方法,两两比较采用Dunnett-T3方法,实验结果以平均值±标准差表示。全部实验数据采用SPSS19.0统计软件进行分析,p0.05视为差异具有统计学意义。主要结果： 1、醋酸铅引起PC12细胞增殖能力显著下降,凋亡水平上升。 MTT法检测结果显示各剂量组细胞活性之间有显著性差异(F值=386.421,P=0.000),其中暴露于1μm醋酸铅的PC12细胞增殖能力降低(95.0%±3.8%),与对照组比较有显著性差异(P=0.04),而暴露于10μM和100μm醋酸铅的PC12细胞增殖能力分别为69.8%±2.8%和51.4%±3.8%(P=0.00；P=0.00)。流式细胞仪结果显示,0.1μM、1μM、10μM, and100μM暴露组的凋亡率分别为1.33%±0.42%,5.40%±0.51%,38.33%±3.06%,46.67%±4.51%。说明随着醋酸铅染毒浓度的升高,细胞的增殖能力逐渐下降,凋亡水平逐步升高。 2、醋酸铅引起PC12细胞凋亡相关基因Bax表达上升,Bcl-2表达下降,Bax/Bcl-2比值上升,并呈剂量反应关系。 RT-PCR分析结果显示,各剂量组细胞Bax基因mRNA表达之间有显著性差异(Welcl值=103.674,P=0.000),其中1μM、10μM、100μM组细胞Bax基因mRNA表达与对照组细胞比较有显著性差异(P=0.011；P=0.034；P=0.008),说明随着醋酸铅浓度增高,细胞Bax基因mRNA表达逐渐下降。各剂量组细胞Bcl-2基因mRN表达之间有显著性差异(Welch值=363.691,P=0.000),其中10μ M、100μm组细胞Bcl-2基因,mRJA表达与对照组细胞比较有显著性差异(P=0.049；P=0.027),说明随着醋酸铅浓度增高,细胞Bcl-2基因mRNA表达逐渐升高。 3、抗氧化剂N-乙酰基半胱氨酸(NAC)可以抑制醋酸铅引起的ROS水平增高、线粒体跨膜电位降低及细胞凋亡。经过NAC预处理后,荧光显微镜下,NAC预处理组ROS生成水平明显低于未处理组(P=0.000)；线粒体跨膜电位NAC预处理组高于未处理组(P=0.000)；暴露10μM醋酸铅的PC12细胞凋亡率下降至14.33%±1.53%。 4、通过EF1A-EGFP稳定转染PC12细胞,构建了共培养体系,在荧光显微镜下可以区分染毒与未染毒细胞。荧光显微镜下,稳定转染PC12细胞呈现绿色加蓝色核染,而正常细胞仅为蓝色核染。 5、细胞荧光免疫示踪法(Parachute Assay)显示GFP-PC12(Pb2+)细胞和PC12细胞之间建立了细胞间隙连接通讯。荧光显微镜下稳定转染PC12细胞将绿色染料传递给周围正常细胞,CBX可以有效组织这种传递。说明稳定转染PC12细胞与正常细胞之间建立了缝隙连接。 6、GJIC阻断剂甘珀酸(CBX)可以部分阻断醋酸铅诱发的旁观者效应在共培养体系中,ROS水平GJIC阻断剂甘珀酸(CBX)处理前PC12细胞的(3.48±0.59),处理后为(1.64±0.42),差异有显著性(P=0.000)。凋亡水平GJIC阻断剂甘珀酸(CBX)处理前为(43.52%±8.07%),处理后为(12.19%±1.13%),差异有显著性(P=0.000)。线粒体跨膜电位处理前低于处理后。结论： 1、醋酸铅可诱导PC12细胞凋亡的线粒体途径。 2、醋酸铅对PC12细胞造成的损伤可以传递给周围正常细胞。 3、细胞间隙连接通讯GJIC在铅诱导的旁观者效应中起了重要的作用。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R135.1

【参考文献】