miR-23b在BDE47诱导CYP3A1表达中的调控作用及机制研究

发布时间：2019-06-14 08:46

【摘要】：目的：本研究旨从细胞和整体水平研究miR-23b调控BDE47诱导CYP3A1表达、活性及功能的重要作用及分子机制,为深入阐述BDE47的生物毒效应及健康危害,并为环境污染物的健康风险评估提供理论依据和技术支撑。 方法：首先利用表达CYP3A1酶的大鼠H4ⅡE细胞株,通过CCK-8. Western Blot、 siRNA干扰、CYP3A诱导剂(地塞米松,DEX)处理和免疫荧光等试验确定BDE47的毒性剂量及BDE47对CYP3A1的诱导作用。然后通过生物信息学预测和real-time PCR验证,进一步确认目标mcroRNA (miR-23b),在此基础上,运用双荧光素酶报告基因实验明确miR-23b和CYP3A1(大鼠)/CYP3A4(人)的靶向关系。然后利用microRNA的功能实验(miR-23b过表达和抑制表达试验)验证miR-23b对CYP3A1/CYP3A4的调控作用。最后通过Lenti viral-anti-miR-23b漫病毒和BDE47联合处理大鼠,检测动物样本miR-23b水平、CYP3A1表达水平和活性变化,以及GC-MS检测样本BDE47原形和代谢产物的含量,进一步验证niR-23b在调控BDE47诱导CYP3A表达及其功能中的重要作用。 结果： 1.不同浓度的BDE47处理H4IIE细胞,可引起细胞活力呈剂量依赖性下降,DEX(CYP3A1诱导剂)预处理可明显增强BDE47所致的细胞毒性；CYP3A1-siRNA转染H4IIE细胞后,BDE47(20μM)的细胞毒性明显下降。免疫荧光及Western Blot实验显示,BDE47可以显著诱导CYP3A1的表达。 2.利用生物信息学软件(miRanda-mirSVR、miRBase19、RNAhybrid、miRecords和PITA)初步确认了miR-23b可能与CYP3A的调控表达有关,研究结果显示,BDE47处理的细胞及BDE47染毒的大鼠肝脏组织中,miR-23b都显著下降。 3.报告基因实验结果显示,miR-23b可以分别和大鼠CYP3A1的3'UTR和人CYP3A4的CDS结合发挥调控作用,miRNA结合大鼠CYP3A1位点在3'UTR(+1620-+2790),而在人CYP3A4的CDS区的具体作用位点,分别位于(+450-+750)、(+1150-+1400)、(+1490-+1710)。 4. miR-23b mimic转染H4ⅡE细胞24h后,CYP3A1的表达下降,BDE47的细胞毒性显著降低；而miR-23b inhibitor处理,则CYP3A1表达升高,BDE47的细胞毒性显著增强。 5.特异性抑制：miR-23b表达的micro-down'漫病毒和BDE47联合处理大鼠,大鼠肝脏1niR-23b表达显著减少,而CYP3A1蛋白表达和活性显著升高；通过GC-MS检测发现,抑制miR-23b表达后,BDE47染毒大鼠的血清和肝脏中BDE47原形的含量显著下降,而血清中3种BDE47的代谢产物3-OH-BDE47、4'-OH-BDE49和4-OH-BDE42都显著增加,但肝脏中的BDE47代谢产物未见明显改变。 结论： 1.BDE47能够诱导H4ⅡE细胞CYP3A1的表达,BDE47可通过诱导CYP3A1的表达而增强其毒效应。 2.证实：niR-23b与CYP3A的互补关系及结合靶点(大鼠CYP3A1的3’UTR和人CYP3A4的CDS区域),提出miR-23b可能在CYP3A的调控中发挥重要作用； 3.细胞和动物实验证实了miR-23b可调节CYP3A1的表达,miR-23b可以通过调控CYP3A1表达及活性而影响BDE47的代谢并进而影响其毒效应。
[Abstract]:Objective: the purpose of this study was to study the important role and molecular mechanism of miR-23b regulating the expression, activity and function of CYP3A1 induced by BDE47 at the cellular and overall level, so as to provide theoretical basis and technical support for further expounding the biological toxic effects and health hazards of BDE47, and providing theoretical basis and technical support for health risk assessment of environmental pollutants. Methods: first, the rat H4 鈪，

本文编号：2499262