低剂量镉暴露对大鼠生殖发育毒性及胎盘屏障相关的蛋白质组学研究

发布时间：2019-09-03 20:16

【摘要】：重金属镉,广泛应用于化工、电子和核工业等领域。自1955年日本富山县神通川发生著名于世的痛痛病以来,镉对机体的损害及其防治方面已引起世界各国的高度关注。联合国国际环境规划署和国际劳动卫生重金属委员会已将镉列入重点研究的环境污染物,世界卫生组织则把其作为优先研究的食物污染物。我国的镉污染现状一样严峻,人们不仅通过吸烟、饮水和空气吸入等途径生活性暴露,而且更为严重的是用途广泛的职业性暴露,电池加工、染料涂料、电镀、塑料定型、合金生成以及核反应堆的控制棒等各行各业均使用镉原料。虽然近年工艺改进大大限制了镉的用量,但是镉长达15-30年的蓄积期使得其远期效应不容忽视。加上职业接触镉的工人大都处于青壮年时期,因此长期蓄积在其体内的镉的生殖毒性及其对子代的远期影响都亟待研究和解决。镉是多系统、多器官毒物,尤其易蓄积在肝脏、肾脏、骨骼和生殖系统,胎盘也是镉的靶器官之一。同时孕期胎盘作为一种保护性屏障,对镉暴露的作用与其它重金属如铅、汞等存在差异。镉、铅虽然在体内的生物转化过程相似,但对胎盘的通透性截然不同。胎盘对铅几乎没有或只起微弱的屏障作用,孕妇体内的铅90%以上会通过胎盘传输给胎儿。相比之下人群报道脐血镉大概只有母血镉的10%。虽然镉也能部分通过胎盘,但是通透的局限性表明胎盘对镉具有明显的屏障作用,但是究竟哪些蛋白涉及镉在胎盘的转运不得而知。富含半胱氨酸的金属硫蛋白(metallothionein, MT)对镉有明显的解毒作用。它不但可以调节必需金属元素的内平衡,抗氧化,保护DNA损伤,而且还与血管再生、细胞存活、凋亡和增殖有关。国外研究表明,镉暴露会诱导胎盘组织MT的表达,减轻镉在动物胚胎脑组织中的蓄积。MT的半胱氨酸过氢巯基基团(SH)能强烈螯合有毒金属,所以它不仅可以通过结合镉离子进行解毒,也可以通过结合不同亲和力的铜和锌等其它金属离子释放出已结合的镉离子,调节体内微量元素的平衡。因此胎盘中的MT对胎儿的生长发育具有重要的保护作用。但是MT在机体内是非特异性结合多种2价游离金属,铅、汞等重金属同样可以诱导胎盘组织中MT的合成以减轻其毒性。所以MT是否可以作为重要的调节因子部分屏障胎盘对镉的通透,目前还不能确定。而且,最近一些研究指出可能是非MT结合的镉从母体向胎儿转运。此外,金属转运因子DMT1和ZIP14都涉及胎盘对镉的摄取和转运。因此,我们推测可能有其它非MT蛋白参与胎盘对镉的转运。所以,为探讨胎盘对镉转运的分子机制以及低剂量暴露下镉的生殖发育毒性,本实验模拟一代繁殖毒性实验,使用雌性SD大鼠连续2个发情周期、妊娠期和哺乳期持续经口染毒,探讨胎盘对镉的屏障作用并观察镉暴露对母体及子代的影响。人群在职业和生活中的长期低剂量镉暴露的生物效应与体内、体外实验条件下的高剂量短期诱导的作用截然不同,所以真实模拟人群的实际暴露水平,进行实验动物的验证,合理的剂量设置至关重要。课题组查阅了大量国外文献,大多数动物实验均使用1～5mg/kg·bw·d作为长期毒性和致癌实验的剂量范围。日本学者持续2年对年幼雌性Wistar大鼠给予1mg Cd/L的饮水染毒,他们认为1mg/kg·bw·d的大鼠经口染镉剂量呈现与人群镉日常摄取量的相似效应。综合分析,并结合前期研究基础和预实验检测结果,本实验采用1mg/kg·bw·d的染毒量作为繁殖毒性实验的低剂量暴露,按大鼠经口染毒肠道镉吸收率0.36-0.54%计算,实际摄入量最低为3.6 ug/kg·bw·d,略高于WHO允许镉通过饮食的1 w最大摄入量7ug/kg·bW。随着人类基因组计划(human genomic project,HGP)的提前完成,蛋白质组学的理论系统和技术方法已经成为后基因组时代的主旋律。因为蛋白质组学研究具有大规模、高通量、高灵敏度的特点,所以可以有效地、客观地分析细胞内的蛋白质整体。差异蛋白质组学通过比较样本间蛋白质表达水平的变化,寻找差异分子,用来解决各种各样的生物学问题。目前已涌现出大量新的差异蛋白质组分析方法,其中荧光差异凝胶电泳(difference gel electrophoresis, DIGE)技术由于继承了二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)的高分辨率,而且又具备高重现性、高灵敏度、高通量和高动态范围等的优势,使得DIGE日益受到关注,成为最受欢迎的定量蛋白质组学研究方法之一。综上所述,为了寻找胎盘对低剂量镉暴露的屏障作用相关的差异蛋白质,本实验建立了低剂量镉暴露的一代繁殖毒性实验动物模型,以易于通透胎盘屏障的低剂量铅暴露作为阳性对照,观察低剂量镉暴露对SD大鼠的生殖发育毒性；利用基于DIGE-基质辅助激光解吸离子化-飞行时间/飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight/time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF/TOF)-生物信息学(bioinformatics)的差异蛋白质组学技术平台,分析低剂量镉暴露胎盘屏障特异的靶蛋白,探讨胎盘对镉转运的分子机制。动物实验结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析。连续性变量符合正态分布时采用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用两组独立样本t检验,多组间的比较采用方差分析(analysis of Variance, ANOVA)。不符合正态分布时采用中位数和四分位数间距(median, inter-quartile range)表示,两组间比较采用两组独立样本秩和检验,如方差不齐或不符合正态分布,则多组间的比较采用多组独立样本秩和检验。分类变量采用构成比(P)表示,各组之间的构成比比较采用χ2检验。结果表明,染毒19d开始,Cd-M、Cd-H组雌鼠体重增长缓慢(P0.05),Cd-L口Pb组体重虽然低于对照组,但差异无统计学意义(P0.05)：而且染毒20d时,Cd-L组血镉浓度为12.09 (10.42～14.57)μg/L, Pb组血铅浓度为119.93(105.83～130.45)μg/L；染毒44d时,尿镉浓度为5.48(4.03～9.23)μg/L,尿铅浓度为127.38(97.00～160.22)μg/L。参照我国人群相关的职业卫生标准,说明本试验低剂量的镉、铅设置合理。染毒44d后(孕期满20d)结果显示,母鼠血镉/铅的浓度分别为16.70±4.77/284.95±149.49μg/L(P0.05),但是脐血的浓度明显不同,脐血镉约为母血镉的8.38%(P0.05),脐血铅为母血铅的58.20%(P0.05)。结果证实相对于低剂量铅暴露,胎盘确实对低剂量镉有明显的屏障作用。对孕期满20d和哺乳28d的雌鼠繁殖指数指标分析显示,Cd-L组与对照组相比均无差异(P0.05),说明在lmg/kg·bw·d的经口暴露染毒剂量下,SD雌性大鼠未见明显的母体毒性。但胎鼠及仔鼠的发育指数则有异常发现,孕期满20d剖杀时Cd-L组胎鼠的体重和胎盘重量均较对照组升高(P0.05)。Cd-L组每窝产仔数的均数为10.00±3.46只,对照组为10.71±2.93只,差异无统计学意义(P0.05),可以基本排除Cd-L组每窝产仔数目少导致胎鼠体重和胎盘重量增加的影响因素。而且哺乳28d剖杀时对照组、Cd-L、Cd-M和Cd-H组每窝产仔数的均数分别为12.33±2.66只、7.60±4.04只、9.50±3.07只、10.83±1.94只,统计发现仅Cd-L组每窝产仔数低于对照组(P0.05),但Cd-L组和Cd-M组仔鼠自出生后体重就一直高于对照组直到哺乳期结束(P0.05),Cd-H组由于较高剂量的毒性影响仔鼠则一直是低于对照组体重的相反变化(P0.05)。综合分析,说明排除每窝产仔数目的影响,可能有其他因素导致较低剂量镉暴露的仔鼠体重增加,我们分析可能与镉作为环境污染物具有类雌激素作用相关。本实验不足之处在于没有检测仔鼠阴道口开口时间和体内的激素水平,不能说明较低剂量镉暴露对仔鼠体重的直接影响,但是镉类雌激素作用与仔鼠体重增加的关系值得今后进一步深入探讨,并在人群监测中加以重视。蛋白质组学分析发现,根据DIGE的差异图谱并结合Decyder分析软件寻找差异倍数上调1.5倍或下调1.5倍以上的差异蛋白点。经过胶内差异分析和胶间差异分析,Cd-L组和对照组相比较,共找到了11个差异蛋白点,其中上调的有2个,下调的有9个；Cd-H组和对照组相比较,共找到了6个差异蛋白点,其中上调的有4个,下调的有2个；Pb组和对照组相比较,共找到了28个差异蛋白点,其中上调的有19个,下调的有9个。有些差异蛋白点在几组之间均有变化,共分析出32个差异蛋白质点。利用全自动切胶仪Spot picker挖取这些差异蛋白胶粒,然后进行样品胶内酶解,使用ABI 4800 MALDI TOF/TOF质谱仪进行分析。通过Mascot软件检索SwissProt数据库鉴定蛋白,去除鉴定结果相同的蛋白点,共鉴定出17种蛋白质。对鉴定出的所有17种差异蛋白进行生物信息学的功能分析,包括利用亚细胞定位软件WOLF PSORT进行亚细胞定位分析；利用蛋白质数据库的蛋白质结构域(domain)和模体(motif)的分析,检索蛋白质的功能进行分析。从这些蛋白质中,筛选出5种可能与镉毒效应相关的候选靶蛋白质进一步验证。其中ATP结合转运蛋白ATP-binding cassette sub-family B member 4 (Abcb4)和 ATP-binding cassette sub-family G member 2 (Abcg2)与代谢产物、药物和外源性毒物等多种底物的转运密切相关；热休克蛋白90kDaβ1 (Hsp90pl)经常和78kDa糖调节蛋白(Hspa5)以及其它辅分子伴侣组成蛋白质复合物发挥内质网应激蛋白的作用；抑制素蛋白Prohibitin (Phb)由于其在线粒体内膜、细胞核内、质膜上的多种定位以及功能的多效性列入下一步的验证实验。为了验证上述5种蛋白的表达变化及在组织中的定位情况,利用Western blot及免疫组化实验对DIGE结果进行验证。实验结果表明,不同剂量的镉暴露对大鼠胎盘组织Abcb4、Abcg2和Phb的表达和定位有一定影响。Abcb4和Abcg2蛋白在镉暴露组表达下降,且下降趋势呈现剂量反应关系；Phb蛋白在镉暴露组表达增加,免疫组化显示低剂量镉暴露组Phb蛋白在迷路滋养层表达增多。Western blot的验证结果与DIGE趋势基本一致,不同之处在于本实验DIGE检测结果发现Abcg2蛋白在低剂量镉暴露组表达升高,与Western blot验证其表达降低的结果不一致；另一个靶点为1443的蛋白,经鉴定同样为抑制素蛋白,DIGE中的趋势为同对照组比较无明显变化,与Western blot验证其表达增加的结果不一致。我们分析可能与蛋白的修饰有关,由于Western blot检测用的抗体是检测总蛋白,而DIGE检测发现的差异蛋白点可能是经过修饰后的蛋白,所以在蛋白表达趋势上出现不一致的变化。本研究模拟职业人群和生活污染的镉暴露水平,通过建立一代繁殖毒性实验的SD大鼠妊娠动物模型,采用DIGE分离-MALDI TOF/TOF质谱鉴定-生物信息学分析的差异蛋白质组学技术,研究低剂量镉暴露胎盘屏障作用的靶蛋白以及镉的生殖发育毒性,得出如下3点结论：1.成功建立了低剂量镉暴露的动物模型,通过染毒不同时期血/尿镉水平的动态监测,结合我国人群相关的职业卫生标准,证实本试验低剂量的镉暴露设置合理。实验结果表明在1、3、9mg/kg·bw·d的镉78d经口暴露剂量下,未见明显的母体生殖毒性；在1、3mg/kg·bw·d的镉较低暴露组,出现胎鼠/仔鼠体重增加的趋势,在9mg/kg·bw·d的镉高暴露组,出现仔鼠体重减低的趋势。分析原因较低剂量组胎鼠/仔鼠体重增加可能与镉的类雌激素作用相关,镉高剂量暴露可以导致仔鼠低体重。低剂量镉暴露类雌激素作用与仔鼠体重增加的关系及机制值得今后进一步深入探讨,并在人群监测中加以重视。2.进一步验证了低剂量镉暴露胎盘的屏障作用,并且成功建立了低剂量镉暴露的DIGE差异图谱,质谱分析后得到32个差异蛋白质点,共鉴定出17种差异蛋白质。结合蛋白亚细胞定位分析,蛋白质结构域和模体信息,筛选出5种与胎盘屏障作用相关的候选靶蛋白质进一步验证。推测这些差异蛋白可能影响镉在胎盘的转运,并与镉暴露导致胎盘氧化应激损伤的功能调控有关。3.利用Western blot及免疫组化实验对Abcb4、Abcg2、Hsp90β1、 Hspa5和Phb蛋白进行验证,并观察这5种蛋白在组织结构中的定位及表达。结果表明,Abcb4和Abcg2蛋白在镉暴露组表达下降,而且下降趋势呈现剂量反应关系；Phb在镉暴露尤其是低剂量镉暴露组表达增加,并且在迷路滋养层表达增多；而Hsp90β1、Hspa5蛋白表达水平和DIGE结果不一致。我们推钡Abcb4和Abcg2蛋白表达下降可能影响镉在胎盘的转运,并对子代的发育产生毒效应；Phb蛋白可能由于低剂量镉暴露对胎盘组织的氧化损伤,产生应激性过表达,正向调控Nrf-2加强抗氧化功能,影响胎盘对镉的通透及转运。同时Phb表达升高,抑制镉与雌激素受体介导的信号转导及基因转录,影响镉在胎盘的转运,发挥胎盘的屏障作用。但具体的作用机制有待于设计进一步的实验加以验证和探讨。本实验不仅为低剂量镉暴露的生殖发育毒性研究提供了动态的实验数据,而且为探讨Abcb4和Abcg2蛋白对镉暴露胎盘转运的影响提供了线索,为研究Phb蛋白在镉致胎盘氧化应激损伤反应中的分子机制提供了依据。
【图文】：

变化趋势,体重,暴露剂量,围产期

异无统计学意义（ｆ＞０．０５）；围产期结束后中、高剂量染Zf组雌鼠体重仍低于逡逑对照组，而且部分时段与对照组相比差异有统计学意义（尸＜０．０５）。雌鼠体重逡逑变化趋势见下图１－１，表１－５详细列出各时段雌鼠平均体重。结合图表结果提示逡逑本试验福、铅不同暴露剂量设定合理，符合本试验低剂量暴露的研究目的。逡逑３２０邋［逦一－〔Ｄ咖！逦Ｉ逡逑—？Ｃｄ－Ｌ逡逑３００邋－叫／邋；邋＼逡逑Ｉ逦＃邋１＾＾逡逑ｉ邋２６０－逦＾逡逑置邋２４。．逡逑。。产邋＇ｕ逡逑１邋４邋７邋１０邋１３邋１６邋巧邋２２邋巧巧邋３１邋３４邋３７邋４０邋４３邋巧巧邋５８邋R%邋６４邋６７逦７３逡逑染辜时间ｗ）逡逑图１－１染毒期间雌鼠体堇变化趋势逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｂｏｄｙ邋ｗｅｉｇｈｔ邋ｉｎ邋ｐａｒｅｎｔａｌ邋ｆｅｍａｌｅｓ逡逑１４逡逑

对照组,诊断标准,慢性铅中毒,尿铅

锅和尿铅水平均明显升高，差异有统计学意义（尿锅：巧＝３２．２８０，／＾＜０．００１；尿逡逑铅：Ｚ＝－２．０５２，户＝０．０４０）。多重比较提示各染毒组与对照组相比差异均有统计逡逑学意义（户＜０．０５），具体数据见表１－６和图１－３，１－４，邋１－５，邋１－６。结合人群ＧＢＺ邋１７逡逑－２００２《职业性铜中毒诊断标准》和ＧＢＺ邋３７－２００２《职性慢性铅中毒诊断标准》，逡逑动态监测雌鼠体内暴露水平，保证低剂量暴露客观、真实。逡逑表１－６染毒２０ｄ和４４ｄ铜／铅含量（微克／升）逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－６邋Ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋Ｃｄ／Ｐｂ邋ｏｎ邋Ｄａｙ邋２０／４４邋ｇａｖａｇｅ邋ｉｎ邋ｐａｒｅｎｔａｌ邋ｆｅｍａｌ巧（｜ｉｇ／Ｌ）逡逑２＾逦Ｗｄ逡逑分组逦显e逦显霜逦Ｗｍ逦尿霜逡逑尸５０（b6２５，尸７５）逦b6５０（b6２５，户７５）逦b6５０（户２５，，户７５）逦户５０（户２５，户７５）逡逑Ｅｏｎｔｆｏｌ逦０．３６逦４５．８５逦１．９０逦４７．７４逡逑（ｎ＝ｉ６）逦（０．２３，０．８４）逦（３４．０２，６６．３３）逦（１．１６，２．６８）逦（３５．７５，１１２．０６）逡逑Ｃｄ－Ｌ逦１２．０９＊逦５．４８＊逡逑（ｎ＝１６）逦（１０．４２，１４．５７）逦一逦（４．０３户祖）逦—逡逑Ｃｄ－Ｍ逦３１．３８＊逦１２．９４＊逡逑（ｎ＝１６）逦口６．７６，３４．３７）逦—逦（８．０５，１４．９０）逦—逡逑Ｃｄ－Ｈ逦６４．１３＊逦１４．４３＊逡逑（ｎ＝１６）逦（５９．５４
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114

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