环介导等温扩增技术在食品中痢疾志贺氏菌快速检测

发布时间：2020-02-16 13:33

【摘要】：【目的】探讨、优化基于环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的方法。【方法】在NCBI数据库中搜索获取志贺氏菌的特异性基因高度保守区,设计3对LAMP反应引物,建立、优化该LAMP可视化检测方法,并评价其特异性、灵敏度,同时与PCR检测方法和传统检测方法对比,进行结果统计分析。【结果】5株志贺氏菌标准菌株样品均检测为阳性,11株非志贺氏菌标准菌株样品均检测为阴性,无交叉反应。最低检验限为1.6×101 CFU/反应(或1.6×101 CFU/m L),且经比较,LAMP检测灵敏度比PCR检测高出1个数量级。通过对161份实际样品和人工污染样品进行检测,LAMP检测与传统方法检测结果具有较高的一致性。【结论】LAMP具有检测过程快速简便、检测结果稳定、可靠的特点,适用于对常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的高效、快速检测需求。
【图文】：

显色,志贺氏菌,颜色变化

NTPs(10mmol/L)2μL、3对引物混合物(FIP/BIP1.6μmol/L，FL/BL0.8μmol/L，F3/B30.2μmol/L)2μL、DNA模板2.5μL、显色液2.5μL、超纯水2.5mL。充分混匀后置于水浴锅中61°C反应50min，最后经肉眼观察，根据检测管中显色试剂的颜色变化判读检测结果，具体为阳性显示绿色，阴性显示浅橙红色(未变色)，并经琼脂糖凝胶电泳检测观察各个样品反应情况，阳性样品检测管呈明显荧光绿，条带清晰，阴性样品检测管未见颜色变化，未见明显条带，见图1、2。另外，PCR反应体系为：10×PCRbuffer2.5μL，TaqDNApolymerase(5U/μL)图1LAMP快速检测显色图Figure1ResultsofchangeincolorofLAMP-baseddetectionmethod注：M：MarkerDL2000；1：非志贺氏菌标准菌株样品；25：志贺氏菌标准菌株样品.Note:M:MarkerDL2000;1:Non-Shigellastandardsample;25:Shigellastandardstrainsamples.

电泳图,电泳图,志贺氏菌,稀释倍数

周杨等:环介导等温扩增技术在食品中痢疾志贺氏菌快速检测2251Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn图2LAMP快速检测电泳图Figure2ElectrophoreticresultsofLAMPproductofchangeincolor注：M：MarkerDL2000；1：非志贺氏菌标准菌株样品；25：志贺氏菌标准菌株样品.Note:M:MarkerDL2000;1:Non-Shigellastandardsample;25:Shigellastandardstrainsamples.1μL，dNTPs(10mmol/L)0.5μL，引物混合物(PF/PR0.5μmol/L)2.5μL，DNA模板2.5μL，超纯水16μL。PCR反应条件为：94°C5min；94°C30s，57°C30s，72°C30s，35个循环；72°C5min，其结果经琼脂糖凝胶电泳检测观察。2.2特异性试验5株志贺氏菌标准菌株样品均显示明显荧光绿色，，即为检测阳性；而11株非志贺氏菌标准菌株样品仍为反应前的浅橘红色，即为检测阴性，且以上平行测试结果一致，见表2。2.3灵敏度试验当稀释倍数在100106倍时，对应的检测管均显示明显荧光绿色，即为检测阳性；而稀释倍数在107108时，对应的检测管仍为反应前的浅橘红色，即为检测阴性，见图3，以上平行测试结果一致。并经琼脂糖凝胶电泳检测以上不同浓度样品对应的反应产物，显示出明显的梯状条带，见图4。而PCR检测结果显示，只有在稀释倍数在100105倍时，出现较明显的产物条带，见图5。经比较LAMP检测灵敏度比PCR检测高出1个数量级，LAMP检验限达到1.6×101CFU/mL。表2特异性检测结果Table2Resultsofspecificity菌株名称Strainname菌株编号Strainnumber检测结果DetectionresultS.dysenteriaeCMCC(B)51105+S.flexneriCMCC(B)51572+S.sonneiCMCC(B)51592+S.flexneriATCC12022+S.boydiiATCC9207+V.parahaemol

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