原花青素在t-BHP致HEI-OC1细胞氧化损伤中的作用及机制研究

发布时间：2020-03-25 04:53

【摘要】：目的1初步探索Nrf2信号通路在t-BHP致HEI-OC1细胞氧化损伤中的作用。2探讨原花青素在t-BHP致HEI-OC1细胞氧化损伤中的作用及机制。方法1采用t-BHP染毒HEI-OC1细胞,设置对照组与50μM、100μM、200μM三个染毒组,于染毒12h后分别检测细胞生存率(CCK-8法)、检测细胞内ROS水平(流式细胞术)及细胞凋亡率,验证氧化损伤模型是否构建成功。2进行实时荧光定量PCR试验,检测氧化损伤模型下HEI-OC1细胞中Nrf2、HO-1、GSTα1、GCLC、GCLM、NQO1 m RNA的表达水平。3应用Western Blot试验检测氧化损伤模型下HEI-OC1细胞中HO-1、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白的表达水平。4使用CCK-8法进行细胞毒性试验,分别观察原花青素对正常状态下HEI-OC1细胞生存率的影响以及原花青素对氧化损伤模型下HEI-OC1细胞生存率的影响,从而筛选出较适宜的原花青素作用时间及药物浓度。5对原花青素干预后的HEI-OC1细胞进行流式细胞试验,用DCFH-DA探针法检测HEI-OC1细胞内ROS水平,Annexin V-FITC/PI双染法检测HEI-OC1细胞凋亡情况。6对原花青素干预后的HEI-OC1细胞进行实时荧光定量PCR试验,分别检测HEI-OC1细胞中Nrf2、HO-1、GSTα1、GCLC、GCLM、NQO1 m RNA的表达水平。7通过Western Blot试验检测原花青素干预后的HEI-OC1细胞中HO-1、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白的表达水平。结果1 CCK8检测结果显示随着t-BHP染毒浓度的增加,细胞的增殖能力呈明显的下降趋势(F=322.8,P0.001)。DCFH-DA探针标记和Annexin-V/PI双染流式细胞术检测结果显示随着t-BHP染毒浓度的增加,细胞内ROS水平增加,细胞的早期凋亡率与晚期凋亡率也呈一定的升高趋势。2 RT-PCR结果表明,HO-1、GCLC、GST-α1基因表达水平升高,并随着t-BHP染毒浓度的增加,基因表达水平呈现一定的升高趋势;Nrf2、GCLM基因表达水平在200μM时有统计学差异(F=10.39,P0.01;F=13.33,P0.01);NQO1基因表达水平升高,但仅在100μM时有统计学差异(F=4.77,P0.05)。3 Western Blot结果表明,cleaved-caspase-3、Bax、HO-1蛋白表达的水平随着t-BHP染毒浓度的增加呈现一定的升高趋势(P0.05),Bcl-2蛋白表达水平降低。4 CCK8法检测细胞存活率,结果显示,与对照组相比,0-20mg/L的原花青素(PC)对细胞存活率无明显改变,而40、80mg/L的原花青素显著降低细胞存活率(85.66±3.0,39.74±2.04,F=311.3,P0.001)。在氧化损伤细胞模型中,加入不同浓度PC干预6、12、24h后,干预12h时,不同浓度的PC对细胞保护作用呈现一定的增强趋势,20mg/L PC对细胞保护作用相对较大(F=26.23,P0.001)。5 DCFH-DA探针标记和Annexin-V/PI双染流式细胞术检测结果显示,原花青素干预后,原花青素各组(5、10、20mg/L)细胞内ROS荧光Mean值分别是损伤组的0.82倍(P0.05)、0.70倍(P0.001)、0.56倍(P0.001)。原花青素各组(5、10、20mg/L)凋亡区细胞分别为损伤组的0.55倍(P0.001)、0.64倍(P0.001)、0.85倍(P0.05)。6 RT-PCR结果表明,给予原花青素干预后,仅HO-1、GCLM、GST-α1 m RNA表达水平升高,且在低浓度干预下有统计学差异(P0.05)。与损伤组相比,NQO1、GCLC、Nrf2 m RNA随着干预浓度的增加呈现一定的降低趋势。7 Western Blot结果表明,原花青素干预后Bcl-2、HO-1蛋白表达的水平随着染毒浓度的增加呈一定的升高趋势(P0.05),cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平降低。结论1 t-BHP可诱导HEI-OC1细胞发生氧化应激反应,并导致细胞凋亡。2 t-BHP通过激活Nrf2/ARE信号通路,促进其下游保护基因的表达。3原花青素可能通过抑制线粒体凋亡途径而对HEI-OC1细胞起到保护作用。
【图文】：

结 果结 果 损伤模型的建立C1 细胞正常状态下生长状况 HEI-OC1 细胞是单层贴壁生长型细胞，易被消化，贴壁能力比细胞传代 2h 后才开始贴壁，8h 时基本贴壁完全。贴壁后的细胞，形态均匀，透光性好，轮廓清晰，密度低时可呈放射状生长，边缘转角处的细胞密度较高，其余细胞密度较低且分散均匀（见之间连接成片，互相依靠、紧密衔接，呈“铺路石”状，为较典

图 2 HEI-OC1 细胞表面标志物鉴定本课题组前期建立的 t-BHP 致 HEI-OC1 细胞氧化损伤与凋亡的细HP 终浓度分别为 50μM、100μM 与 200μM 的轻、中、重度氧化损。8 法检测 t-BHP 对 HEI-OC1 细胞增殖活力的影响 CCK8 法检测 t-BHP 对 HEI-OC1 细胞增殖活力的影响，结果显示以上，随着染毒浓度的增加，，细胞的增殖活力呈现明显的降低趋势（1）；低、中、高浓度染毒 12h，各组的细胞增殖活力分别为对照组的001），0.62 倍（P<0.001）与 0.52 倍（P<0.001），200μM 的 t-BHP使细胞增殖基本抑制（表 2，图 3）。表 2 不同浓度的 t-BHP 处理 12h 对细胞增殖活力的影响（x±s）t-BHP（μM） Cell viability（％）
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R135.8

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 王宁;马慧萍;漆欣筑;蒙萍;贾正平;;Nrf2-ARE信号通路在机体氧化应激损伤防护中的研究进展[J];解放军医药杂志;2015年12期

2 张晓晖;曾繁典;孙智达;杨卓欣;熊益群;徐超英;刘心亮;林坚;穆桂萍;徐绍钢;刘文赫;;原花青素B_2对LPS诱导的心肌细胞凋亡的保护作用[J];中国药理学通报;2015年11期

3 葛萨萨;郑贵亮;周义德;;氧化应激在噪声性聋发病中的作用机制及干预[J];中华耳科学杂志;2014年02期

4 陈丽云;吴艳青;张正红;罗倩萍;王正朝;;NADPH氧化还原反应平台及其在AngⅡ介导ROS信号通路中的调节作用[J];生理科学进展;2012年06期

5 杨玲;许速;;氧化应激与疾病发生的相关性[J];西南国防医药;2012年11期

6 张晓晖;;葡萄籽原花青素体外抗血小板聚集的机制研究[J];中国病理生理杂志;2012年04期

7 王新中;;您了解噪声性耳聋吗[J];人人健康;2012年07期

8 官清;张珩;石晓琳;;原花青素药用研究进展[J];临床合理用药杂志;2012年04期

9 江蓓;李保应;甄军晖;李宪花;胡昭;高海青;;葡萄籽原花青素通过Nrf2调节糖尿病大鼠肾组织GSTM的表达[J];中国病理生理杂志;2011年08期

10 陈建勇;王聪;王娟;曹礼荣;;MAPK信号通路研究进展[J];中国医药科学;2011年08期

本文编号：2599430