siRNA沉默IGFBP5对人胚肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

发布时间：2020-04-05 16:39

【摘要】：目的用硅肺患者肺泡巨噬细胞的上清培养液刺激人肺成纤维细胞(MRC-5)建立体外硅肺模型;应用RNA干扰技术沉默MRC-5中IGFBP5基因,免疫细胞化学法和ELISA法检测MRC-5细胞中I型和III型胶原的表达和含量,探讨IGFBP5基因与硅肺纤维化的关系。方法1体外硅肺模型建立:于应急管理部尘肺病康复中心取得II期硅肺患者的支气管肺泡灌洗液中的肺泡巨噬细胞,体外培养18h后收集用含SiO_2(50μg/ml)的培养液刺激肺泡巨噬细胞所获得条件培养上清,用条件培养上清与MRC-5共孵育建立体外硅肺模型。2 IGFBP5干扰质粒构建及最佳干扰质粒的选择:上海吉玛公司构建IGFBP5干扰质粒及阴性质粒,将干扰质粒及阴性质粒转染入MRC-5内,48h后采用RT-PCR和Western blot法筛选出干扰效率最高的载体。3实验分组:分为空白组(C)、SiO_2刺激组(S)、质粒转染组(T)和阴性质粒转染组(N)。4 MRC-5中I型和III型胶原蛋白的表达和含量的测定:各组MRC-5培养12小时(半天)、24小时(一天)、36小时(一天半)、48小时(两天)和60小时(两天半)后,ICC法和ELISA法检测两种胶原蛋白的表达和含量。结果1大容量双肺灌洗术后灌洗液中获得含有大量活化的巨噬细胞,经二氧化硅粉尘二次刺激后获得条件培养上清。2条件培养上清能有效地刺激MRC-5细胞产生I、Ⅲ型。3干扰质粒转染后激光共聚焦显微镜下观察质粒:脂质体LipofectamineTM2000=2ug:3ul时,细胞转染效率最高。4通过RT-PCR、Western-blot方法检测四种质粒转染后IGFBP5mRNA和蛋白的表达,四种质粒都能不同程度的沉默IGFBP5基因,干扰质粒转染MRC-5细胞的IGFBP5的mRNA和蛋白的相对表达量较空白组均有降低,四组质粒转染组蛋白的相对表达量与阴性质粒转染组相比,与对照组相比,均具有统计学意义,RT-PCR方法(F=156.478,P0.05),Western-blot方法(F=967.144,P0.05),其中质粒A的效果最明显,降低IGFBP5的蛋白效果最好。5 ICC法和ELISA法检测MRC-5中的I、III型胶原的表达和含量相同时间点C组MRC-5中的I、III型胶原的表达和含量最低,S组和N组MRC-5中的I、III型胶原的表达和含量最高,S组和N组表达无差别,P0.05。T组MRC-5中的I、III型胶原的表达和含量明显低于S组和N组,高于C组,两两比较差异有统计学意义,P0.05。同一组不同时间点比较MRC-5中的I、III型胶原的表达和含量,12h、24h、36h、48h、60h五个时间点,可见I型胶原的表达和含量36h小时达到峰值,III型胶原的表达和含量48h小时达到峰值。结论1利用RNA干扰技术,将IGFBP5-SiRNA转染入MRC-5细胞内,可有效抑制IGFBP5基因的表达。2沉默硅肺相关上调基因IGFBP5后,经AM上清刺激的MRC-5细胞内I、III型胶原蛋白表达量减少。图10幅;表7个;参77篇。
【图文】：

巨噬细胞

在全麻状态下行大容量双肺灌洗术，取得灌洗液经过过滤、离心后得到的细胞团细胞主要以激活的巨噬细胞为主，调整细胞浓度细胞总数 6×108/ml 左右，，经台盼蓝试验检验细胞的存活率；将存活的细胞分别置于无菌培养瓶和六孔板中，常规培养 2 小时，倒置显微镜下观察 AM 细胞贴壁成功，带回中心实验室继续在培养箱中培养 24 小时。应用 HE 染色观察巨噬细胞的一般形态、抗酸染色排除结核杆菌感染巨噬细胞和瑞氏-吉姆萨染色证实为巨噬细胞。HE 染色结果：镜下可见巨噬细胞体积较大，细胞呈圆形或椭圆形，细胞浆嗜酸性红染，胞核嗜碱性蓝染，居于中央或一侧，细胞核肾形，较多细胞胞浆内可见大量遮光性颗粒状物质，为巨噬细胞吞噬的粉尘颗粒（图 3 ）。抗酸染色结果：抗酸染色主要排除结核杆菌感染，巨噬细胞胞浆呈紫蓝色，胞浆内未见染色的结核杆菌（图 4）。瑞氏-吉姆萨染色结果：常用于血涂片中各种细胞的鉴定，镜下可见细胞核呈紫红色，胞浆呈紫蓝色，胞浆内可见吞噬颗粒，为巨噬细胞（图 5）

巨噬细胞,瑞士

在全麻状态下行大容量双肺灌洗术，取得灌洗液经过过滤、离心后得到的细胞团细胞主要以激活的巨噬细胞为主，调整细胞浓度细胞总数 6×108/ml 左右，经台盼蓝试验检验细胞的存活率；将存活的细胞分别置于无菌培养瓶和六孔板中，常规培养 2 小时，倒置显微镜下观察 AM 细胞贴壁成功，带回中心实验室继续在培养箱中培养 24 小时。应用 HE 染色观察巨噬细胞的一般形态、抗酸染色排除结核杆菌感染巨噬细胞和瑞氏-吉姆萨染色证实为巨噬细胞。HE 染色结果：镜下可见巨噬细胞体积较大，细胞呈圆形或椭圆形，细胞浆嗜酸性红染，胞核嗜碱性蓝染，居于中央或一侧，细胞核肾形，较多细胞胞浆内可见大量遮光性颗粒状物质，为巨噬细胞吞噬的粉尘颗粒（图 3 ）。抗酸染色结果：抗酸染色主要排除结核杆菌感染，巨噬细胞胞浆呈紫蓝色，胞浆内未见染色的结核杆菌（图 4）。瑞氏-吉姆萨染色结果：常用于血涂片中各种细胞的鉴定，镜下可见细胞核呈紫红色，胞浆呈紫蓝色，胞浆内可见吞噬颗粒，为巨噬细胞（图 5）
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R135.2

【参考文献】