BMSCs-CM介导内质网应激对肺泡巨噬细胞自噬的调控

发布时间：2020-04-07 19:11

【摘要】：目的1建立矽肺大鼠模型及体外染尘细胞模型,证实二氧化硅(SiO2)粉尘可以诱导内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)的激活。2探讨能否通过抑制SiO2诱导的内质网应激降低矽肺发生发展过程中的自噬水平。3探讨骨髓间充干细胞条件培养基(Bone Marrow Stem Cell Conditioning Medium,BMSCs-CM)是否能够通过调控内质网应激来抑制自噬的发生,延缓矽肺进程。方法:本研究将分为体内、外实验两个部分开展,分别从动物以及细胞领域进行探讨研究。1体内实验动物分组及模型制备:45只成年雄性SD大鼠,随机分成3组:对照组,模型组,IRE1抑制剂组,每组15只。模型组、IRE1抑制剂组采用非暴露式气管插管一次性灌注SiO2粉尘混悬液(50g/L)建立矽肺大鼠模型,对照组注入等量灭菌NaCl。IRE1抑制剂组大鼠通过腹腔注射方式给予STF083010(1.0mg/kg),每3天注射一次,余两组等量灭菌NaCl处理。各组于造模3、7、14天分批处死5只大鼠。检测方法:肺组织苏木素—伊红(HE)染色验证造模是否成功。肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophage,AM)HE染色观察其形态学改变;免疫印迹法检测IRE1、LC-3、Beclin-1蛋白的表达情况;免疫荧光法检测IRE1、LC-3蛋白在AM中定位。2体外实验动物分组及模型制备:选取约4周龄、质量约110g的SPF级雄性SD大鼠作为提取BMSCs的动物供体。另取50只SPF级健康成年雄性SD大鼠获取AM,将AM分为4组:对照组仅加入无血清培养液,处理组加入SiO2粉尘悬液(50μg/ml)建立体外矽肺模型。IRE1抑制剂组加入40μmol/L的STF-083010试剂,BMSCs-CM组加入等体积已制备好的条件培养液。各实验组完成相应的实验处理后分为6h、12h、18h、24h、36h。免疫印迹法检测GRP78、IRE1、LC-3、Beclin-1表达量。计算结果差异有统计学意义用P0.05表示。结果:1形态学观察贴壁后原代BMSCs细胞体积小,呈圆形或扁圆形,平形状或漩涡状排列生长,第三代BMSCs形态更趋于均一,镜下观察如成纤维细胞样,核清晰,胞浆丰富。2肺组织形态学结果:对照组大鼠肺泡壁薄,组织结构清晰,间质均匀透亮。模型组大鼠3d时可见浸润的炎性细胞,肺泡腔少有浆液性渗出,肺泡间隔增厚,水肿不明显。7d时肺泡间隔明显增宽变厚,肺间质内出现以肺泡巨噬细胞为主的炎性浸润。14d时肺泡间隔增厚明显,肺组织结构不清,出现大量纤维组织增生,有矽结节形成。3 AM的形态学观察结果:对照组贴壁后的AM细胞呈扁圆形或球形,核质结构清晰。与对照组相比,矽肺模型组AM体积增大,分布生长不均一,部分细胞核表现为单侧分布,胞质疏松,胞内可见点样硅尘晶体。BMSCs-CM组AM生长优于矽肺模型组,多数细胞的形态规则,核质结构清晰。4Western blot检测结果:体内实验结果显示对照组IRE1、LC-3、Beclin-1蛋白呈基础表达,各时间点表达无明显变化;矽肺模型组比较对照组各蛋白表达量在7d、14d明显高于同期对照组(P0.05),随时间成增量表达。体外实验结果显示IRE1、GRP78、LC-3、Beclin-1蛋白在对照组中仅有基础表达,各时间点无明显变化,矽肺模型组各蛋白表达量在6h后随时间延长逐渐增高,直至18h达高峰,高于同期对照组基础表达(P0.05)。相比矽肺模型组,IRE1抑制剂组、BMSCsCM组的各蛋白在各时间表达显著下降(P0.05),BMSCs-CM组与IRE1抑制剂组相比各蛋白表达差异不大,总体趋势相似。免疫荧光结果显示在体内实验中IRE1、LC-3呈胞浆表达,3d、7d、14d不同时间点的对照组仅有基础表达,相比同期,模型组IRE1、LC-3荧光明显增强,抑制剂组比模型组IRE1、LC-3荧光表达减弱,随时间呈动态变化。结论1硅尘颗粒可诱导大鼠肺泡巨噬细胞发生内质网应激。2 IRE1抑制剂STF083010能够抑制矽肺大鼠肺泡巨噬细胞内质网应激反应,延缓其自噬过度激活效应;3 BMSCs-CM可阻断大鼠肺泡巨噬细胞部分因内质网应激效应发生的自噬激活,对矽肺大鼠肺泡巨噬细胞产生一定保护作用。
【图文】：

相差显微镜,肺泡灌洗液,贴壁细胞,细胞形态

细胞形态变得更加均匀、丰富，成梭形样（图1）。1.2.2 AM 的形态学观察肺泡灌洗液中AM占绝大多数，其他非贴壁细胞经离心，种植培养，换液后被去除，最终得到的AM细胞纯度可在95%以上。镜下观察获取的模型对照组AM呈卵圆形，部分未贴壁细胞体积偏小（图2）。图 1 倒置相差显微镜下 BMSCs 形态学观察 ×200Fig.1 Cell morphology of BMSCs observed under inverted phase contrast microscope

大鼠肺泡巨噬细胞,对照组,细颗粒物,点片

未见硅沉着吞噬颗粒。模型组、IRE1抑制剂组AM体积较对照组增大，呈圆形或不规则形，胞核位于一侧或中央，，可见散在的细颗粒物，点片状细胞碎片（附图3）图 3 大鼠肺泡巨噬细胞 14d 形态学观察×200 A.对照组；B.模型组；C.STF083010 干预组Fig.3 Morphological observation of rat alveolar macrophages for 14 days图 2 倒置相差显微镜下 AM 形态学观察 ×400Fig.2 AM morphology observation under inverted phase contrastmicroscope
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R135.2

【参考文献】