LTBP2在镉致16HBE细胞毒性损伤中的作用

发布时间：2020-04-07 23:03

【摘要】：1背景研究发现,镉会通过职业接触、吸烟和食用受污染的水及食物等途径暴露,引起肝脏、肾脏、肺脏、骨骼、大脑、生殖等多种器官及血液系统的损害甚至致癌。然而,镉的毒作用致癌分子机制目前尚不完全清楚。有研究认为镉可通过以下几方面发挥作用:氧化应激、抑制DNA损伤修复、DNA异常甲基化、抑制细胞凋亡、影响细胞周期调控、致多种基因异常表达、雌激素样效应、促进肿瘤干细胞生长、慢性炎症刺激。LTBP2(Latent transforming growth factor-βbinding protein 2)是潜在转化生长因子结合蛋白2,目前研究发现LTBP2与甲状腺癌、肝癌、多器官肿瘤等肿瘤疾病的发生发展有关。但其与环境化学物损伤作用机制还未见报道,本文拟检测氯化镉致人支气管上皮细胞(16HBE)急性损伤后LTBP2基因表达水平,并在LTBP2缺陷细胞模型上研究镉致细胞急性损伤的变化,探讨LTBP2基因在氯化镉致损伤毒性中的机制。2目的2.1在本课题组前期建立的镉恶性转化16HBE细胞模型的基础上,检测16HBE细胞生物信息。在不同恶转代数的16HBE mRNA表达谱中发现LTBP2基因的差异化表达,深入地查找LTBP2基因的位点和形态等生物学特性。2.2利用本课题组成功构建的,镉亚慢性染毒后的动物模型,观察LTBP2 mRNA在不同亚慢性染毒后组织(心、肝、肾、肺)中的表达规律,探讨镉致动物损伤模型组织中LTBP2的作用。2.3在16HBE细胞经氯化镉恶性转化后的不同阶段中验证LTBP2的差异表达;在成功构建LTBP2低表达稳定细胞株后,观察LTBP2低表达对细胞形态及细胞增殖等一般生物学特性的影响,研究LTBP2基因在镉恶性转化毒性中的作用。2.4 16HBE细胞经不同浓度,不同时间氯化镉染毒,检测LTBP2 mRNA表达变化,并用不同浓度,不同时间的氯化镉染毒LTBP2低表达细胞株,检测细胞抑制率、细胞凋亡、DNA损伤、细胞氧化应激等指标,研究LTBP2基因对镉致细胞急性毒性损伤的影响。3方法3.1采用qRT-PCR实验方法检测LTBP2基因的差异表达,使用RNA干扰技术和慢病毒转录技术构建稳定低表达LTBP2基因的细胞系,检测一般生物学性状的变化。通过MTT、CCK8、流式细胞术、彗星实验、色素C及氧化指标试剂盒检测LTBP2基因对细胞抑制率、细胞凋亡、DNA损伤、色素C含量、MDA含量、SOD活力等方面的影响。3.2统计学方法:实验数据通过SPSS 16.0软件分析,计量资料经正态性检验服从正态分布者,采用?x±s表示。每个样本3个平行,实验重复3次。三组及以上组间均数比较采用单因素方差分析(总体方差齐,进一步通过SNK-q检验进行多重比较)或Kruskal-Wallis H检验(总体方差不齐,进一步通过Dunnett's T3检验进行多重比较)。两组独立样本采用t检验。氯化镉剂量与相应指标的关系采用一元线性回归分析,以α=0.05作为检验水准。4结果4.1 LTBP2基因在镉致16HBE恶性转化细胞中的表达:qRT-PCR法检测细胞LTBP2基因表达,恶性转化前细胞(14 th)和恶性转化细胞(35 th)中LTBP2 mRNA相对表达分别为2.04±0.36,5.93±0.60,与16HBE对照组相比,恶转前细胞和恶转细胞分别增加2.04倍和5.93倍,差异有统计学意义(P0.05)。4.2 LTBP2在亚慢性染毒大鼠组织中的表达情况:通过亚慢性镉染毒大鼠模型,发现LTBP2在肺、心、肝各组织表达增加,肺组织低、中、高剂量染毒组LTBP2基因的表达量分别为1.98±0.15、1.40±0.26、1.32±0.10,与对照组相比表达增高,差异有统计学意义(P0.05);LTBP2在心脏组织不同染毒组中的表达量分别为1.16±0.16、1.97±0.19、2.02±0.13,中高剂量组与对照组相比,表达增高,差异有统计学意义(P0.01);肝脏组织LTBP2表达量分别为1.33±0.35、1.22±0.25、1.19±0.10,各组无明显差异(P0.05);肾脏组织低、中、高染毒组分别0.15±0.03、0.70±0.16、0.88±0.10,与对照组比较,低剂量组和中剂量组表达降低,差异有统计学意义(P0.01)。在染毒大鼠中,氯化镉染毒刺激肺、心、肝组织中LTBP2 mRNA表达,特别在心脏组织中,高剂量染毒组LTBP2 mRNA表达量最高。在肺组织中,LTBP2随着染毒剂量的增加而下降,存在剂量-反应关系。4.3 LTBP2在镉致16HBE急性损伤中的表达水平:16HBE细胞经10、20、30、40μmol/L CdCl_2分别处理24 h,采用qRT-PCR测定LTBP2基因相对表达。与CdCl_2未染毒细胞相比,有显著性差异(P0.05)。随着氯化镉染毒剂量的上升,LTBP2mRNA表达逐渐升高,变化趋势呈现明显的剂量-效应关系(P0.01)。用30μmol/L CdCl_2分别处理16HBE细胞12、24、48 h,与CdCl_2未染毒细胞相比,差异有统计学意义(P0.05)。随着染毒时间的增加,LTBP2 mRNA表达逐渐升高,变化趋势呈现明显的时间-效应关系(P0.01)。4.4 LTBP2低表达对一般生物学性状的影响:采用慢病毒载体介导细胞转染,成功构建了LTBP2低表达细胞株:16HBE-shLTBP2细胞,LTBP2低表达对细胞形态结构、细胞增殖率无明显影响。4.5 LTBP2低表达对镉致细胞生长抑制的作用:16HBE细胞经不同浓度CdCl_2分别处理24 h,细胞抑制率逐渐升高,变化趋势呈现明显的剂量-效应关系(P0.01)。与16HBE相比,相同浓度CdCl_2处理的16HBE-shLTBP2抑制率显著降低,且差异具有统计学意义(P0.01)。用30μmol/L氯化镉处理16HBE及16HBE-shLTBP2细胞不同时间,在24、48、72 h,与16HBE相比,相同时间处理的16HBE-shLTBP2细胞抑制率显著降低,且差异具有统计学意义(P0.05)。4.6 LTBP2低表达对色素C含量的影响:利用细胞色素C试剂盒检测16HBE细胞急性染毒模型对细胞凋亡的影响。用30μmol/L CdCl_2处理细胞12、24、48、72 h,在12,48,72 h时,16HBE-shLTBP2的色素C浓度显著高于16HBE(P0.05)。用10、20、30、40μmol/L CdCl_2处理16HBE细胞24 h时,在10、20、40μmol/L时,16HBE-shLTBP2的色素C浓度显著高于16HBE(P0.05)。4.7 LTBP2低表达对镉致细胞氧化损伤的作用:不同浓度CdCl_2处理16HBE及LTBP2低表达细胞株16HBE-shLTBP2细胞不同时间,与16HBE相比,CdCl_2处理的16HBE-shLTBP2 SOD活力显著升高(P0.01)。而与16HBE相比,CdCl_2处理的16HBE-shLTBP2 MDA含量显著降低(P0.05)。4.8 LTBP2低表达对镉致细胞凋亡的影响:分别用不同浓度(10、20、30、40μmol/L)、不同时间(12、24、48和72 h)CdCl_2处理LTBP2系列细胞株,利用流式细胞术检测细胞凋亡率。在24 h CdCl_2处理模型中16HBE-shLTBP2细胞的凋亡率均高于同处理组正常16HBE细胞;在30μmol/L CdCl_2处理不同时间模型中也发现16HBE-shLTBP2细胞的凋亡率均高于对照细胞。4.9 LTBP2低表达对镉致细胞DNA损伤的作用:不同浓度镉染毒细胞时,对于16HBE-shLTBP2组,TL、TD(%)、TM和OTM值4个损伤指标均随着其染毒浓度上升增大。在各个染毒浓度,16HBE-shLTBP2组与同组16HBE细胞相比,其4项损伤值均明显高于16HBE细胞组,且具有统计学差异(P0.05)。在30μmol/LCdCl_2处理下,在12、24、48 h染毒时间组,16HBE-shLTBP2组的4项损伤指标均与16HBE组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。在72 h染毒时间组,两组细胞间的4项损伤指标均无统计学差异(P0.05)。5结论5.1在镉致16HBE恶性转化细胞、亚慢性染毒大鼠组织中及不同剂量、不同时间CdCl_2的急性染毒过程中,LTBP2基因随着染毒剂量或恶转程度的增加表达升高,存在明显的剂量反应关系,提示LTBP2基因参与镉引起的急性损伤、亚慢性毒作用,以及恶性转化过程。5.2成功构建了LTBP2低表达细胞株。经CdCl_2处理,与16HBE相比,16HBE-shLTBP2的细胞抑制率、MDA含量降低,SOD含量增加,提示LTBP2基因可能通过氧化应激通道参与镉对细胞急性损伤的过程;16HBE的凋亡率,DNA损伤程度均低于16HBE-shLTBP2,提示LTBP2在镉致细胞急性损伤过程中可能抑制细胞凋亡并参与DNA损伤过程。
【图文】：

基因定位

广州医科大学硕士学位论文结果2.1 LTBP2 基因在镉致 16HBE 细胞恶性转化过程、亚慢性染毒大鼠组织及急性染毒中的表达2.1.1 LTBP2 基因的定位在 NCBI 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）上搜索 LTBP2 在人类基因组中的定位和保守型。Latent transforming growth factor beta binding protein 2（LTBP2）基因位于14q24.3染色体上，处于74,498,183-74,618,609位点之间，全长有120247bp，外显子共有 36 个，是蛋白编码基因。

细胞恶性转化,统计学意义,对照组

注：与对照组相比，** P<0.01，*P<0.05图 2-2 LTBP2 在镉致 16HBE 细胞恶性转化过程中的表达Expression of LTBP2 in cadmium induced malignant transformation of 在亚慢性染毒大鼠组织中的表达情况性镉染毒大鼠模型，发现 LTBP2 在肺、心、肝各组织中高剂量染毒组 LTBP2 mRNA 相对表达分别为 1.98 0.15与对照组相比，表达增高且差异有统计学意义（P<0.05），组 LTBP2 mRNA 相对表达分别为 1.16 0.16、1.97 0.19对照组相比，表达增高，差异有统计学意义（P<0.01）；肝表达分别为 1.33 0.35、1.22 0.25、1.19 0.10，各组无明显中、高染毒组分别 0.15 0.03 、0.70 0.16 、0.88 0.10和中剂量组表达降低，差异有统计学意义（P<0.01）。在激肺、心、肝组织中 LTBP2 mRNA 表达，，特别在心脏组
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

【参考文献】