【摘要】：研究背景三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是工业上常用的有机溶剂之一,通常作为金属部件和电子元件脱脂剂和去污清洗剂而被广泛应用于电镀、五金、电子等行业。长期暴露于TCE的工人可能会引起职业性三氯乙烯药疹样皮炎(occupational dermatitis medicamentosa-like of trichloroethylene,ODMLT),该病主要症状为严重皮疹、发热、肝损害和浅淋巴结肿大,其中严重的肝损伤是患者死亡的主要原因之一。前期研究表明补体激活参与了三氯乙烯致敏小鼠免疫性肝损伤,肝脏组织存在MAC沉积,且肝细胞未见明显裂解死亡,由此可知MAC可能发挥亚裂解作用介导肝脏损伤。亚裂解水平的MAC能够激活细胞内的一系列信号通路,加重炎症反应。MAC能够引起平滑肌细胞、内皮细胞、视网膜色素上皮细胞等多种细胞的NF-κB信号通路的活化。TCE致敏小鼠肝脏组织中沉积的MAC是否通过诱导NF-κB信号通路的活化介导免疫性肝脏损伤有待研究。研究目的通过建立三氯乙烯致敏小鼠模型,采用腹腔注射重组蛋白sCD59-Cys抑制MAC的沉积,检测补体调节蛋白CD59a的表达水平、MAC沉积水平、NF-κB信号通路活化及肝脏损伤的情况,探讨MAC在三氯乙烯致敏小鼠免疫性肝损伤中的作用及可能机制。研究方法6-8周无特定病原体级雌性BALB/c小鼠(n=89),适应性饲养后随机分为空白对照组(n=5),溶剂对照组(n=5),sCD59-Cys对照组(n=5),TCE处理组(n=50),TCE+sCD59-Cys处理组(n=24)。建立TCE致敏BALB/c小鼠实验模型,末次激发后24 h根据皮肤致敏反应评分将小鼠分为致敏组和未致敏组,分别于末次激发后24 h、72 h和7 d处死小鼠。收集血清和肝脏组织。采用HE染色观察小鼠肝脏病理改变,生化试剂盒检测肝功能指标谷丙转氨酶(alanine amiotransferase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST),实时定量RT-PCR检测TNF-α和IL-1βmRNA水平,免疫印迹法检测肝脏CD59a、P-IκBα和核NF-κB p65蛋白表达水平,免疫组织化学法检测肝脏CD59a分布情况和MAC沉积水平。结果1.致敏情况空白对照、溶剂对照组以及sCD59-Cys对照组小鼠背部皮肤均未出现红斑、水肿。TCE处理组致敏率为19/50(38.0%),TCE+sCD59-Cys处理组致敏率为10/24(41.7%)。2.TCE致敏小鼠肝脏损伤组织病理学检测结果显示,空白对照和溶剂对照组小鼠肝脏组织未出现病理学改变;TCE致敏24 h组和72 h组肝脏发生病变,72 h组更为严重,肝细胞发生气球样变性,TCE致敏7 d组肝脏组织恢复正常。肝功能检测结果显示,与空白对照组小鼠相比,溶剂对照组小鼠血清ALT、AST水平无明显变化,差异无统计学意义(P0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏24 h、72 h组ALT、AST水平升高,其中72 h时达到峰值(P0.05),7 d时恢复(P0.05)。3.TCE致敏小鼠肝脏TNF-α和IL-1βmRNA水平升高实时定量RT-PCR结果显示,与空白对照组相比,溶剂对照组小鼠肝脏组织TNF-α和IL-1βmRNA转录水平均无明显差异(P0.05),TCE致敏24 h、72 h组TNF-α和IL-1βmRNA转录水平明显升高(P0.05),均在72 h达到峰值(P0.05),7 d时恢复(P0.05)。4.TCE致敏小鼠肝脏CD59a表达水平降低免疫组织化学法检测显示,空白对照组和溶剂对照组小鼠肝脏组织细胞表面CD59a广泛表达,呈条索状分布,TCE致敏小鼠肝脏组织细胞表面CD59a表达降低,在72 h时表达最低,7 d时恢复。免疫印迹结果显示,与空白对照组相比,溶剂对照组CD59a蛋白表达水平无明显变化(P0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏24 h、72 h组CD59a蛋白表达水平明显降低(P0.05),在72 h时降到最低,7 d时恢复(P0.05)。5.TCE致敏小鼠肝脏MAC沉积水平升高免疫组织化学法检测显示,空白对照和溶剂对照组小鼠肝脏组织无MAC沉积;与溶剂对照组相比,TCE致敏24 h、72 h组肝脏组织有明显可见MAC沉积,且在72 h最为明显,组化评分差异有统计学意义(P0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏7 d组肝脏组织MAC沉积水平无明显差异(P0.05)。6.sCD59-Cys减轻TCE致敏小鼠肝脏损伤组织病理学检测结果显示,溶剂对照组和sCD59-Cys对照组小鼠肝脏组织未出现病理学改变;与TCE致敏72 h组相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h组肝脏组织病理学改变明显减轻,肝细胞水肿减轻。肝功能检测结果显示,与溶剂对照组相比,sCD59-Cys对照组小鼠血清ALT、AST水平无明显变化,差异无统计学意义(P0.05),TCE+sCD59-Cys致敏72 h组ALT、AST水平明显升高(P0.05);与TCE致敏72 h组相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h组ALT、AST水平明显降低(P0.05)。7.sCD59-Cys降低TCE致敏小鼠肝脏MAC沉积水平免疫组织化学法检测显示,sCD59-Cys对照组小鼠肝脏组织无MAC沉积;与溶剂对照组相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h组有明显可见MAC沉积,组化评分差异有统计学意义(P0.05);但与TCE致敏72 h组相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h组肝脏组织MAC沉积水平明显降低,组化评分差异有统计学意义(P0.05)。8.sCD59-Cys抑制TCE致敏小鼠肝脏NF-κB信号通路及炎症水平免疫印迹结果显示,溶剂对照组和sCD59-Cys对照组小鼠肝脏组织P-IκBα及核NF-κB p65蛋白表达水平无明显差异(P0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏72 h组和TCE+sCD59-Cys致敏72 h组肝脏组织P-IκBα及核NF-κB p65蛋白表达水平明显升高(P0.05);与TCE致敏72 h组相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h组肝脏组织P-IκBα及核NF-κB p65蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。实时定量RT-PCR结果显示,与溶剂对照组相比,sCD59-Cys对照组小鼠肝脏组织TNF-α和IL-1βmRNA转录水平均无明显差异(P0.05);与溶剂对照组相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h组肝脏组织TNF-α和IL-1βmRNA转录水平明显升高(P0.05);与TCE致敏72 h组相比,TCE+sCD59-Cys致敏72 h组肝脏组织TNF-α和IL-1βmRNA转录水平明显降低(P0.05)。结论1.补体调节蛋白CD59a参与了TCE致敏小鼠免疫性肝损伤过程;2.TCE致敏小鼠免疫性肝损伤过程中存在NF-κB信号通路的活化;3.重组蛋白sCD59-Cys可能通过抑制MAC的形成进而抑制NF-κB信号通路活化发挥对TCE致敏小鼠肝脏损伤的保护作用。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R135
【参考文献】
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